摘 要

蛋白质组学的关键之一是蛋白质样品的制备，样品制备的质量直接影响双向电泳的效果，采用本方法所用的percoll密度梯度液提取银杏叶绿体，实验条件更容易满足，且通过透射电镜观察，提取的叶绿体平均完整率在85%左右，高质量叶绿体的分离和纯化，降低了样品的复杂性，提高了蛋白质的富集，然后采用本方法所示Tris-平衡酚抽提法与传统的TCA-丙酮沉淀法提取银杏叶绿体蛋白质相比，提高了提取效率，蛋白质质量更好，用于双向电泳实验所得到的图谱清晰，所分离的蛋白点更多,形态更好,条纹影响相对较小,图谱分辨率更高，而且提取过程比普通酚抽法更为简单、方便,有利于减少蛋白降解，从而为银杏叶绿体蛋白质组学研究奠定基础，同时其它富含杂质的木本植物叶片的叶绿体蛋白质组学研究也可借鉴。

关键词：银杏；叶绿体；蛋白质提取；双向电泳

Effects of drought on chloroplast protein of Ginkgo biloba

—Discussion on the extraction of chloroplast

proteins from Ginkgo biloba

ABSTRACT

One of the key in proteins is the extraction of the protein sample. The quality of sample preparation directly affects two-dimensional eletrophoresis result, using this method of percoll density gradient centrifugation extracted chloroplasts of Ginkgo, that experimental conditions can be easily satisfied and the average extraction rate of chloroplast preparation is about 85% based on the transmission electronic microscopy, meanwhile ,it makes possible to characterize all chloroplast proteins completely. Tris- phenol extraction will increase extraction efficiency and obtain higher protein quality compared with traditional tca-acetone precipitation.The two-dimensional electrophoresis method was the best since the 2-D map was clearer and there were more protein spots than the others, which has relatively smaller effect on fringes , better shape and higher resolution. Extraction Process of Tris- phenol extraction is more simple and convenient than common phenol extraction and that help to reduce the protein degradation.Thus for lay a foundation of Ginkgo chloroplast proteomics research, meanwhile, which taken as the standard curve for leaves of other Woody Plants chloroplast proteomics that rich in impurities.

Key words：Ginkgo biloba; chloroplast; protein extraction; two-dimensional electrophoresis (2-DE)

目录

1 引言 - 1 -

1.1 生长发育过程中的叶绿体及蛋白质 - 1 -

1.2叶绿体分离及蛋白质提取 - 1 -

1.3 干旱对于银杏的影响 - 3 -

1.3.1 干旱对叶绿体膜蛋白表达的影响 - 3 -

1.3.2 水分对叶绿体超微结构的影响 - 3 -

1.3.3 对于叶片质膜相对透性 - 4 -

2 实验步骤 - 5 -

2.1 材料与准备 - 5 -

2.1.1 材料 - 5 -

2.1.2 提取溶液和介质 - 5 -

2.2 提取方法 - 5 -

2.2.1 银杏叶片完整叶绿体的提取 - 5 -

2.2.2 透射电镜检测 - 5 -

2.2.3 银杏叶绿体蛋白质的提取 - 6 -

2.2.3.1 Tris-平衡酚抽提法 - 6 -

2.2.3.2 TCA-丙酮沉降法 - 7 -

2．4 SDS-PAGE法检测银杏叶绿体蛋白质提取质量 - 7 -

2.4.1 溶液的配制 - 7 -

2.4.2 凝胶的配制 - 8 -

2.4.3 样品的处理与蛋白的定量 - 8 -

2.4.4 电泳 - 8 -

2.4.5 染色和脱色 - 8 -

2.5 2-DE法检测银杏叶绿体蛋白质提取质量 - 9 -

2.5.1 溶液的配制 - 9 -

2.5.2 第一向等电聚焦（IEF） - 9 -

2.5.3 胶条平衡 - 10 -

2.5.4 第二向SDS-PAGE电泳 - 10 -

3 结果与分析 - 12 -

3 .1 透射电镜检测银杏叶绿体完整率结果与分析 - 12 -

3 .2 图像扫描结果与分析 - 13 -

3 .3 凝胶扫描结果与分析 - 13 -

结 论 - 16 -

致 谢 - 17 -

参考文献 - 18 -

1 引言

1.1 生长发育过程中的叶绿体及蛋白质

绿色植物是通过光合作用来吸收太阳能，同化二氧化碳以及水，制造有机物质并且释放出氧气．光合作用的光反应过程发生在叶绿体内基粒片的层膜上，由光系统Ⅰ(PSⅠ)、光系统Ⅱ(PSⅡ)、细胞色素b6f复合物以及ATP合成酶组成。光合作用的暗反应过程发生在叶绿体基质中，主要是通过卡尔文循环来进行二氧化碳的固定，卡尔文循环包括羧化、还原和二磷酸核酮糖的再生三个阶段，由11种酶协同催化13个连续反应。在光合作用产生氧气的同时，也伴随活性氧(ROS)的产生，在胁迫条件下，过量ROS的产生会对细胞产生伤害，因此植物叶绿体中也存在着活性氧清除机制，叶绿体基因除了具有各自的生理功能外，还可能主动或被动的参与植物对生物和非生物胁迫的反应。

叶绿体是绿色植物把光能转化为化学能的重要细胞器，也是植物进行光合作用的主要场所叶绿体，是半自主性细胞器，含有相对独立的遗传系统，进行自我复制。研究叶绿体蛋白质学对于深入了解叶绿体在光合作用过程中所执行的功能有重要意义^[1-2]。据推测，植物叶绿体中的蛋白质数目有几千个，约占植物总蛋白数目的10%到25%^[3]，其中绝大部分是由核基因编码，并且在细胞质核糖体上合成，然后转运到叶绿体中，只有少数是由叶绿体基因编码，并且在叶绿体的核糖体上翻译。众多研究表明，在不同的逆境条件下，叶绿体及其编码蛋白质会发生不同的形态及生理变化。另外，叶绿体也可作为生物反应器高效表达外源基因，甚至表达疫苗和药物蛋白质等等。

1.2 叶绿体分离及蛋白质提取

银杏(Ginkgo biloba )为银杏科银杏属落叶乔木，素来就有植物界的活化石之称，是现有种子植物中最古老的裸子植物。中国是银杏的故乡，现有的银杏资源约占世界银杏资源的70％以上。银杏是一种集用材、食用、化妆、保健、药用于一体的优良经济树种^[4]，近年来，银杏作为全国各地的重要的绿化树种也得到了广泛的运用。由于银杏是珍贵的孑遗植物，因此具有许多原始特性，是科学家们重点研究的植物品种之一，受到许多不同科研工作者的重视和研究。