无菌松苗的长期培养及其在松树萎蔫病研究中的应用毕业论文

 2021-04-20 11:04

摘 要

松树萎蔫病是松树的毁灭性病害之一,目前对该病的致病机理尚不十分清楚。本研究采用新型培养法进行马尾松无菌苗的培养,并分别采用5月龄左右的无菌实生苗及赤松组培苗,对无菌松材线虫的致病性进行了研究。结果表明,无菌松材线虫和有菌松材线虫均能导致无菌马尾松苗及赤松组培苗发病,而无菌水对照组没有发病。在无菌松材线虫和有菌松材线虫致萎的植株中均可分离到线虫。分离自无菌松材线虫接种植株的线虫于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,30℃下振荡培养3天后,无任何细菌生长,其无菌性得到再次验证。本研究表明,该方法培养的无菌松苗能够用于松材线虫致病性研究,为准确研究线虫与松树相互作用提供了良好的实验材料。

关键词:松材线虫病;松材线虫;无菌苗;致病性

Long-term culture of aseptic pine seedlings and their application in the study of pine will disease

Abstact: Pine wilt disease (PWD) is one of the most serious disease of pine tree. However, the pathogenesis mechanism of PWD remains until now. In this study, a new method has been used for long-term culture of aseptic pine seedlings, and aseptic 5-month-old Pinus massoniana seedlings and 5-month-old microcuttings derived from P. densiflora produced in vitro were inoculated under aseptic conditions with aseptic pine wood nematode (PWN) and non-aseptic PWN to investigate the pathogenicity of PWN. The result showed that the aseptic microcuttings and seedlings inoculated with either aseptic PWN or non-aseptic PWN wilted, while those inoculated with aseptic water did not wilt. Nematodes were recovered from wilted seedlings and microcuttings inoculated with aseptic PWN and non-aseptic PWN, and the asepsis of nematodes recovered from aseptic PWN-inoculated microcuttings and seedlings was reconfirmed by culturing them in NA liquid medium at 30℃ for more than 3 days. Taken together, the results indicate that the aseptic pine seedlings raised by this methods was suitable for the accurate study of PWN- pine interactions.

Keywords: Pine wilt disease; Bursaphelenchus xylophilus; Aseptic pine seedling; Pathogenicity

目 录

1前言 1

1.1松材线虫病病原研究概况 1

1.1.1松材线虫是唯一病原 1

1.1.2松材线虫携带细菌与松材线虫一起导致发病 1

1.2松材线虫病致病机理研究概况 2

1.2.1酶学说 2

1.2.2毒素学说 3

1.2.3空洞化学说 3

1.3松材线虫病的防治 4

1.4本研究的目的和意义 4

2材料与方法 5

2.1供试材料 5

2.2方法 5

2.2.1无菌苗的培养 5

2.2.2无菌松材线虫的培养 6

2.2.3无菌松材线虫致病性的测定 7

3结果与分析 7

3.1种子污染率及无菌萌发率 7

3.2无菌松苗的培养 8

3.3无菌松材线虫对马尾松的致病性 9

3.4无菌松材线虫对赤松组培苗的致病力 10

3.5接种线虫的再分离及无菌再检验 12

4结论与讨论 13

致 谢 16

参考文献 17

1前言

松材线虫病是一种危害松树的毁灭性病害,感病植株迅速枯死,且传播蔓延极快。一旦发病都将造成极为严重的损失,是国际、国内的重要检疫对象。该病目前已在我国17个省市发生,并且呈迅速蔓延扩散的态势,是目前对我国林业危害最为严重的森林有害生物,也对我国以林业为主的生态环境建设造成重大威胁。关于松材线虫的研究已有较多的报道,基于经典与现代生物学的理论与方法,国内外众多学者对松材线虫的生物学、生态学和致病性等进行了深入研究,尤其是日本在20世纪80-90年代做了大量的工作,我国在近些年来也有较多的研究报道[1],研究主要集中在松材线虫的种类鉴定及早期诊断、生物学及致病性、病害控制与防治等方面[2],但是迄今尚未有有效控制措施。

1.1松材线虫病病原研究概况

1.1.1松材线虫是唯一病原

在松材线虫病病原研究方面,目前比较一致的观点是松材线虫在整个病程中起着重要作用,多数学者认为松材线虫是唯一病原,清原和德重接种了9 种松树及2 种针叶树,证明只有将线虫接种到木质部,松树才会死亡。真宫用松材线虫接种了黑松和赤松,引起这两种松树死亡。Bolla 和Jorden将松材线虫经链霉素、青霉素等清毒后,经人工培养基培养,最后得到无菌的松材线虫,其致病性并未丧失。黑田和伊藤用松材线虫接种黑松,一周后黑松的水分输导受到障碍,但松树体内的微生物相和健康松树的一样,直至接种5 周后,兰变菌开始出现,细菌才开始增多。因此,认为接种松材线虫能单独引起松树萎蔫,与其他微生物无关[3]。这些研究表明松材线虫能单一引起松树萎蔫,松材线虫是唯一的病原。

1.1.2松材线虫携带细菌与松材线虫一起导致发病

有少数学者认为松材线虫携带的细菌与松材线虫一起导致发病。奥八郎等人提出使松树萎蔫的毒素可能是松材线虫携带的细菌的代谢产物。Tada肯定了从松材线虫上分离到的细菌具有产生毒素的能力。Kawazu和Kaneko在无菌条件下用无菌松材线虫接种30天苗龄的无菌赤松秒,松苗不死亡;而带细菌的松材线虫在同样条件下,却导致无菌松苗的萎蔫枯死,因此认为细菌才是松材线虫病的真正病原[4-5]。赵博光等亦从松材线虫体表分离到细菌,同时用电子显微镜观察到线虫体表的细菌,但未观察到其体内有细菌存在[6]。洪英娣等发现单独接种无菌松材线虫和单独接种细菌,2个月生无菌黑松苗枯萎不发生或发生不明显,二者混合接种可使无菌松苗枯萎程度加重[6]。Zhao et al.在无菌条件下用从松材线虫体表细菌和无菌松材线虫单独接种4个月生无菌黑松苗,不能使松苗发病,但二者的混合物却可使无菌苗萎蔫,提出松树萎蔫病使松材线虫与细菌共同侵染引起的复合侵染病害的假说[7]。松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种,松枝发病,单独接种松材线虫或坚强芽孢杆菌,松枝不发病[8]。支持这一观点的学者从这一角度证明松材线虫病是由松材线虫和细菌共同引起的,没细菌存在,松材线虫单独不会引起松树萎蔫,实验表明松材线虫病在松材线虫与细菌共同作用的情况下致病。笔者认为细菌是否起作用尚待深入研究,在技术发展成熟的未来能更准确的验证这一说法。

1.2松材线虫病致病机理研究概况

1.2.1酶学说

松材线虫分泌的酶破坏了松树薄壁细胞的壁和膜,导致松树死亡。Kiyohara在对松材线虫病致病机理的研究中,发现松材线虫能分泌多种酶[9],Kojima在对松材线虫的分泌物进行电泳分析时发现,松材线虫的弱毒株系和强毒株系,其所分泌的纤维素酶的谱带类型十分一致,但酶的活性不同[10]。Higgins 等用PCR 扩增松材线虫的cDNA***段,通过对扩增产物的分析发现存在一定数量的几丁质酶同工酶。Kusunoki 把用电镜观察到的细胞壁消解现象归于线虫产生了具有很强活性的纤维素酶和果胶酶作用的结果[11]。除纤维素酶外,松材线虫还可分泌过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶,这些酶也可能参与了病害的初始病理反应。与植物抗性代谢关系较大的酶类主要有过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶等。这些研究将有助于进一步揭示松材线虫病的致病机理。

1.2.2毒素学说

松材线虫入侵松树后,松树体内出现了导致松树死亡的毒素。目前已知至少5种毒性代谢物存在于感染线虫的松树里:苯甲酸和儿茶酚在针叶里,苯甲酸、8羟香芹鞣酮、二氢松柏醇和10-羟基马鞭烯酮于木材中。关于毒素来源的问题,有不同的看法。有人认为,受害松树内产生的致萎毒素是由于松材线虫的侵染而使寄主产生的异常代谢产物[12]。另有人认为,受害松树体内的有毒物质与松材线虫携带的细菌有关[13]。线虫侵染早期,这些毒性代谢物就已产生,随着时间推移累积,并可能抑制树体内的水分运输。它们只能从受线虫侵染的松树里分离到,并且使松苗萎蔫依剂量和树种而定。松材线虫在人工培养条件下不能直接产生有致萎作用的有毒代谢物。随着研究的深入,将会有更多的毒素被分离和鉴定,造成枯死的真正原因也越来越复杂。从现已认定的几种毒素来看, 对松树都显示出毒性,但哪一种是主要原因,目前很难判定,也许这些毒素可交互作用综合致松树枯死 [14]。松树萎蔫病病程中所产生的致萎毒素,是受病原线虫刺激后被诱发而成的寄主异常代谢产物,还是线虫侵染后本身产生的,尚未明确。 

1.2.3空洞化学说

松树感染松材线虫后,木质部内挥发性物质增加,管胞中形成了空洞,致使松树体内水分输导受阻,松树萎蔫死亡。在松树对松材线虫的抗性方面,树种之间抗性的差异性较显著,而同种松树不同地理种源之间抗性的差异性的显著程度因树种而异。就松树的死亡过程而言,形成层活动的下降、某些物质的气化或松脂的渗漏造成的输水堵塞以及来自死亡射线的代谢物等都被认为是十分重要的[15]。Kuroda用松材线虫接种黑松,水分输导逐渐受阻。用致病型和非致病型的松材线虫分别接种黑松,接种致病型的松苗管胞中形成的空洞和薄壁细胞的病变,水分输导受阻[16]。而接种非致病型的松苗中,没有这种变化[17]。由此认为,线虫进入树体后,促进了薄壁组织细胞烯类挥发性物质的产生。单萜烯和倍半萜烯气化后通过薄壁细胞的壁孔外渗进入管胞,导致管胞空穴化。由于它们具有疏水性,而且表面张力强,使管胞不能重新进水,因而阻碍了水分的输导。赵振东等的研究也证明,接种松材线虫后,松树体内的单萜烯和倍半萜烯的含量会发生明显的变化[18]

1.3松材线虫病的防治

到目前为止,松材线虫病的致病机理尚未研究清楚,该病的防治也没有取得突破性进展。由于松材线虫病传播快,一旦发生则很难控制,所以在防治上要贯彻“以防为主,防治并举,防重于治”的方针。国内外学者都进行了多方面深入而细致的研究,但由于松材线虫病传播、发生及危害的特殊性,到目前为止,运用于生产、经济有效的方法并不多[19],目前,常用化学杀虫剂、轮作法及使用抗性品种等来防治植物寄生线虫,抗寄生虫化学药物等来防治动物寄生线虫,而这些传统方法的种种局限令人们把目光投向了极具潜力的生物防治[20]。生物防治有诸多优点,是需要积极开展研究的,但是就松材线虫而言,由于该线虫繁殖速度太快,不可对其生物防治寄予过多希望,更不能夸大生物防治对松材线虫的作用。但是对松材线虫病采取多方法、全方位的综合防治应是努力的方向。目前的研究多处于试验阶段,大面积推广应用还要克服诸多难关,另外还有其他一些尚处于构想或试验阶段的防治方法,短期内也不可能有大的进展。看来,人们只能寄希望于致病机理研究上的突破或许有助于防治上的推进。因此,就目前情况而言,任何单一的防治措施都是难以奏效的。松材线虫病的防治是一项复杂的系统工程,在继续加强科研的同时,还要运用行政、法律等多种手段,调动各方积极性,各有关部门密切配合,将每一项措施都落到实处,这样就可以将松材线虫控制在一定范围内,使病害造成的损失降低到最低限度。

综上所述,松材线虫是个非常复杂的病害。涉及寄主松树、松材线虫、微生物等诸多因子,各因子之间的关系错综复杂。国内外对该病害的研究虽然已有百余年历史,但其病原及致病机理至今尚未能确切阐明。这就要求人们从新的视角,进行更系统、更细致的研究,进一步探明松材线虫病的病原及其发病机制。

1.4本研究的目的和意义

在错综复杂的自然条件下对松苗或成年松树进行接种,或在无菌条件下以生理和结构上与成年松树有很大差别的无菌幼苗进行试验,均较难对松材线虫或其携带细菌的作用进行准确评价。为了准确研究松材线虫及其伴生细菌与宿主松树间的相互关系,需构建一个新的测定体系,即在严格控制的无菌条件下,培育完全木质化的无菌苗木进行接种试验。

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