摘 要

采用传统平板培养法对15株不同来源的松材线虫所携带的细菌进行分离、纯化，得到112株细菌。分别以0.5% 番红、2.0% 番红、1.0% 中性红、1.0% 曙红、0.5% 结晶紫和0.5% 甲基蓝6 种染液探讨了快速鉴别死活松材线虫的染色方法，结果表明，6种染料均未能使活线虫着色，0.5% 番红、2.0% 番红、1.0% 中性红、1.0% 曙红、0.5% 结晶紫染液均能使热杀死的松材线虫着色，0.5% 甲基蓝染液不能使热杀死线虫着色。1.0% 曙红和0.5% 结晶紫2种染液均未能使细菌致死松材线虫很好着色。以松材线虫为靶标线虫，采用96孔生化板对112株细菌进行拮抗筛选，获得13株对松材线虫校正死亡率在80%以上的菌株。复筛结果显示，有4株菌杀线结果较显著，其1d 发酵液的5倍稀释液处理松材线虫24h后校正击倒率达100%。

关键词：松材线虫，细菌，杀线活性，染色

Isolation of Bacteria Associated with Bursaphelenchus xylophilus and Screening of the Stains with Nematicidal Activity

Abstract: A total of 112 bacterial strains were isolated from 15 isolates of Bursaphelenchus xylophilus （pine wood nematode, PWN）by the culture-dependent method. To explore the prompt methods in determination of viability of PWN, the nematodes were stained with 0.5% safranine, 2% safranine, 1.0% neutral red, 1.0% eosine, 0.5% crystal violet or 0.5% methylene blue. The results showed, the vital adults were unstained with all 6 stains. 0.5% safranine, 2% safranine, 1.0% neutral red ,1.0% eosine, 0.5%crystal violet could make heating killed nematodes with colours, while 0.5% methylene blue could not. 1.0% neutral red and 0.5% crystal violet could not make nematodes which was killed by the bacterias dyeing. By using asptic-PWNs as target nematodes, 13 strains which had nematicidal activity to B. xylophilus were selected by using 96 hole biochemical slabs from 112 bacteria strains, the revised knock-down rate of the B. xylophilus over 80%. Rescreening results showed that 4 bacteria strains possessed strong nematicidal activity with lethal rate as high as 100% when their 5-fold dilution from 1d culture filtrate were interaction with nematodes for 24 h.

Key word: Bursaphelenchus xylophilus; Bacteria; Nematicidal activity; Screening

目录

1前言 1

1.1松材线虫病的致病机理 1

1.1.1松材线虫病的病原 1

1.1.2松材线虫病致病机理 1

1.2松材线虫的生物防治 2

1.2.1生物防治的概念和含义 2

1.2.2松材线虫病的防治 2

1.3松材线虫携带细菌的多样性 3

1.3.1松材线虫携带细菌的物种多样性 3

1.3.2松材线虫与其伴生细菌的关系 3

1.3.3细菌对松材线虫的生物防治 4

1.4本研究的目的意义 4

2材料与方法 5

2.1供试虫株 5

2.2方法 6

2.2.1人工饲养松材线虫 6

2.2.1.1 PDA-真菌平板的制备 6

2.2.1.2新鲜疫木中松材线虫的分离及纯化 6

2.2.1.3松材线虫的培养 6

2.2.1.4无菌松材线虫的培养、分离与检验 7

2.2.2松材线虫携带细菌的分离和纯化 7

2.2.2.1 NA培养基的制备 7

2.2.2.2松材线虫携带细菌的分离和纯化 7

2.2.2.3发酵液的获得 7

2.2.2.4菌种的保存 8

2.2.2.5分离细菌的生物学特征 8

2.2.3拮抗细菌的筛选 8

2.2.3.1染色法鉴别线虫死活 8

2.2.3.1.1染液的配置 8

2.2.3.1.2染色 8

2.2.3.2拮抗细菌的筛选 9

3结果与分析 9

3.1松材线虫携带细菌的分离和纯化 9

3.2松材线虫携带细菌的菌落形态及大小 11

3.3 6种染料对松材线虫的染色结果 15

3.4松材线虫拮抗细菌的筛选 16

3.4.1初筛 16

3.4.2复筛 18

4结论与讨论 19

参考文献 21

1前言

松树枯萎病是一种由松材线虫寄生在松属树种内取食营养而导致树木迅速死亡的特大毁灭性病害，属国际重要检疫对象，列为森林病虫害之首，被称为“无烟的森林火灾”，也被称为松树的“癌症”。此病自1905年发现，1934年报道以来，目前已广泛分布于日本、美国、韩国、加拿大、墨西哥、希腊、葡萄牙和中国等国家，并造成了巨大的经济损失^[1]。据2007年我国国家林业局统计，我国松材线虫病疫区已扩大到113个县(区)。每年我国由松材线虫病而造成的直接经济损失已达25 亿元，间接的经济损失达250 亿元^[2]，是森林病害的重大隐患。

1.1松材线虫病的致病机理

松材线虫病涉及寄主、线虫、媒介昆虫、真菌、细菌以及环境因素等多个方面，至今其致病机理尚未弄清。其中比较观点一致的是松材线虫在整个病程中起着重要作用。

1.1.1松材线虫病的病原

目前，对于松材线虫病致病病原普遍有三种看法，一种认为该病完全由松材线虫引起。另一种观点认为病原是细菌，Oku等从松材线虫虫体和感病松树体内分离到一种致病细菌，可使松苗萎蔫，首次提出该病与细菌有关并认为松材线虫病涉及双媒介系统：天牛在树与树之间传播线虫，线虫在树体内传播致病细菌。Kawazu等提出该病的真正病原是松材线虫携带的致病细菌。另外，赵博光等提出该病是松材线虫和其携带致病细菌的复合侵染病害，并通过抗生素控制致病细菌的方法控制松材线虫病^[3]。

1.1.2松材线虫病致病机理

对于松材线虫的致病机理，目前存在3种观点。第一种观点认为松材线虫的酶使松树薄壁细胞的细胞壁和细胞膜遭到破坏，树脂不正常地从树脂道中渗漏并扩散到相邻的管胞中，使水分输导受阻，导致萎蔫。第二种观点认为松树感染了松材线虫后，木质部内挥发性萜烯类物质的含量增加，这些物质进入管胞在管胞中形成空洞，致使水分输导受阻。第三种观点认为松树感染松材线虫后，体内产生有毒物质，这些物质使松树萎蔫^[4]。

1.2松材线虫病的生物防治

1.2.1生物防治的概念和含义

生物防治（biological control）就是利用一种生物对付另外一种生物的方法。生物防治，大致可以分为以虫治虫、以鸟治虫和以菌治虫三大类。它利用了生物物种间的相互关系，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物。它的最大优点是不污染环境，是农药等非生物防治病虫害方法所不能比的。

由于化学农药的长期使用，一些害虫已经产生很强的抗药性，许多害虫的天敌又大量被杀灭，致使一些害虫十分猖獗。许多种化学农药严重污染水体、大气和土壤，并通过食物链进入人体，危害人群健康。利用生物防治病虫害，就能有效地避免上述缺点，因而具有广阔的发展前途。

1.2.2松材线虫病的防治

生产上常采用化学杀线虫剂来防治植物寄生线虫病害，但目前市场上杀线虫剂品种少、毒性高，且长期单一的施用高毒、高残留化学杀线虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，农产品中农药残留严重超标，同时线虫抗药性问题也日益突出。近些年来随着绿色农业口号的提出，化学农药的使用越来越受到限制，除了继续探索低毒、低残留、高选择性的化学农药外，人们更关注开发生防制剂以作为化学农药的补充或替代品^[5]，生物防治线虫病害已受到广泛重视^[6]。