摘 要

近年我国杨树溃疡病发生危害严重，利用微生物间的竞争及拮抗，用筛选的拮抗菌对杨树溃疡病进行生物防治可降低杨树溃疡病的发病率，从而有效的控制杨树溃疡病的发生。本实验室前期从广西林科院马尾松林根际土壤中分离筛选获得一株水拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）JZ-GX1，已测定其具有较强的降解植酸盐能力，对松树、杨树表现出显著的促生作用。本试验针对水拉恩氏菌对杨树溃疡病菌的拮抗作用，对其拮抗效果进行了测定，并对其产拮抗物质的最佳发酵工艺进行了优化。结果表明，水拉恩氏菌JZ-GX1胞外代谢产物对杨树烂皮病菌金黄壳囊孢拮抗效果明显。同时有利于菌株JZ-GX1抗菌物质产生的最佳发酵培养基质为牛肉膏、鱼粉和碳酸钙；培养基初始pH、培养时间、温度、转速等对菌株生长及其抗菌物质的产生有明显的影响，在1/3装液量，初始pH8.5，温度为16℃，转速为240r/min下培养21h可获得较高产量的胞外代谢抗菌产物。

关键词：水拉恩氏菌；杨树溃疡病菌；拮抗作用；发酵优化

The Antagonism of Rahnella aquatilis JZ-GX1 to Poplar Canker Pathogens and optimizating the fermentation process of producing antibacterial substance

Abstract

In recent years, the incidence of poplar canker causes severe loss of timber, many researchers use the competition and antagonistic of microorganisms, through the antagonistic bacteria to conduct biological control of poplar canker and inhibit the reproduction of poplar canker fundamentally and reduce the incidence of poplar canker, which effectively control the occurrence of poplar canker. Our laboratory isolated Rahnella aquatilis JZ-GX1 from the rhizosphere soil of mason pine in Guangxi Academy. We have determined it has a strong ability to degrade phytate, and some related research also shows significant growth-promoting effect to pines and poplars.We against the antagonism of Rahnella aquatilis JZ-GX1 conduct a series of studies. Detecting the antagonism of Rahnella aquatilis JZ-GX1 and exploring the best liquid fermentation conditions which can product antagonistic substance, optimizing its fermentation process.The results showed the obvious effect of JZ-GX1 extracellular metabolites to Cytospora chrysosperma. At the same time, beef extract,fish mealand calcium carbonate were optimum for production of antagonistic substance by Rahnella aquatilis JZ-GX1. The initial pH, shake-incubation time, temperature and rotational speed influenced the growth of strain JZ-GX1 and secretion of antibacterial substance. The initial medium pH8.5,1/3 liquid volume in flask, shake-incubation for 21h and 30℃were optimum for fermentation of the strain JZ-GX1.

Keywords: Rahnella aquatilis; Cytospora chrysosperma; antagonistic action; fermentation optimization

目 录

第一章 文献综述 - 1 -

1 杨树溃疡病的发生及防治现状 - 1 -

1.1 杨树溃疡病的种类及发生危害 - 1 -

1.2 杨树溃疡病的防治现状 - 2 -

1.2.1 营林措施 - 2 -

1.2.2 选育抗病树种 - 2 -

1.2.3 化学防治 - 3 -

1.2.4 生物防治 - 3 -

2 拮抗微生物的研究现状 - 4 -

2.1 拮抗微生物的种类 - 4 -

2.2 拮抗微生物的作用机制 - 5 -

2.2.1 拮抗作用 - 5 -

2.2.2 重寄生作用 - 6 -

2.2.3 诱导抗性作用 - 6 -

2.2.4 营养竞争 - 6 -

3 水拉恩氏菌概述 - 7 -

4 本研究目的与意义 - 7 -

第二章 水拉恩氏菌JZ-GX1对林木病原菌的拮抗作用 - 9 -

1 材料与方法 - 9 -

1.1 材料 - 9 -

1.1.1 供试细菌 - 9 -

1.1.2 供试病原菌 - 9 -

1.1.3 供试植物材料 - 9 -

1.1.4 培养基 - 9 -

1.2 方法 - 9 -

1.2.1 水拉恩氏菌JZ-GX1菌体拮抗能力测定 - 9 -

1.2.2 水拉恩氏菌JZ-GX1代谢产物拮抗能力测定 - 9 -

2 结果与分析 - 10 -

2.1 水拉恩氏菌JZ-GX1对几种林木病原菌的平板拮抗效果 - 10 -

2.2 JZ-GX1胞外代谢产物对金黄壳囊孢和拟茎点霉抑菌效果 - 11 -

3 结论与讨论 - 12 -

第三章 水拉恩氏菌JZ-GX1产抑菌物质发酵工艺优化 - 13 -

第一节 水拉恩氏菌JZ-GX1发酵培养基的优化 - 13 -

1 材料与方法 - 13 -

1.1 供试细菌 - 13 -

1.2 供试病原菌 - 13 -

1.3 培养基 - 13 -

1.4 试验方法 - 13 -

2 结果与分析 - 14 -

2.1 水拉恩氏菌JZ-GX1培养基优化单因素结果 - 14 -

2.1.1 不同碳源对JZ-GX1抑菌率的影响 - 14 -

2.1.2 不同氮源对JZ-GX1抑菌率的影响 - 14 -

2.1.3 不同无机盐对JZ-GX1抑菌率的影响 - 15 -

2.2 水拉恩氏菌JZ-GX1培养基优化正交试验结果 - 15 -

第二节 水拉恩氏菌JZ-GX1产抑菌物质发酵工艺的优化 - 17 -

1 材料与方法 - 17 -

1.1 材料 - 17 -

1.1.1 供试细菌 - 17 -

1.1.2 供试病原菌 - 17 -

1.1.3 培养基 - 17 -

1.2 试验方法 - 17 -

1.2.1 培养时间的确定 - 17 -

1.2.2 培养温度的筛选 - 17 -

1.2.3 初始 pH 的筛选 - 18 -

1.2.4 不同转速的影响 - 18 -

1.2.5 优化结果验证 - 18 -

1.3 数据处理 - 18 -

2 结果与分析 - 18 -

2.1 不同发酵时间对JZ-GX1抑菌活性的影响 - 18 -

2.2 不同发酵温度对JZ-GX1抑菌活性的影响 - 19 -

2.3 不同发酵pH对JZ-GX1抑菌活性的影响 - 20 -

2.4 不同发酵转速对JZ-GX1抑菌活性的影响 - 21 -

2.5 JZ-GX1发酵条件优化后抑菌效果比较 - 22 -

第四章 结论与展望 - 24 -

1 结论 - 24 -

2 展望 - 24 -

致 谢 - 25 -

参考文献 - 26 -

1. 文献综述

1 杨树溃疡病的发生及防治现状

1.1 杨树溃疡病的种类及发生危害

我国的杨树溃疡病绝大多数由真菌引起（许文力等，1997），已报道的病原真菌类群至少包括8个属，如葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）、聚生小穴壳属（Dothiorella）、腐皮壳菌属（Valsa）、疡壳孢属（Dothichiza）、壳梭孢属（Fusicoccum）、大茎点霉属（Macrophoma）等均可侵染杨树并导致溃疡病的发生（李传道1985，1979）。其中，对林业生产造成巨大损失的溃疡类病害的病原主要是葡萄座腔菌属（引起水泡型溃疡病）和腐皮壳菌属（引起烂皮型溃疡病）（张星耀等，2003）。向玉英等（1979）在对杨树水泡型溃疡病的病原菌鉴定报导以后，才首次确认杨树水泡型溃疡病由真菌群生小穴壳（Dothiorella gregaria）引起，其有性阶段为茶麓子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），同物异名为Botryosphaeria ribis。汪太振等（1981）研究了杨树烂皮病，该病害的病菌有性世代是污黑腐皮壳菌（Valsa sordid），无性世代是金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）。赵经周（1982）以杨树大斑型溃疡病的名字对疡壳孢病菌做了研究，调查该病可危害50多个杨树品种，认为青杨派树种和以青杨为母本的杂交种受害最重。

由此可见，杨树溃疡病菌有很多种，并且绝大多数为真菌所引起（许文力，1997；袁嗣令，1997；张星耀等，2003）。许文力等（1997）则对杨球二孢溃疡病、大斑溃疡病、水泡型溃疡病、烂皮病、拟茎点孢溃疡病等不同溃疡病种类作了介绍。李凯和袁鹤（2012）也对杨树溃疡病中的水泡型溃疡病、大斑溃疡病、烂皮型溃疡病和细菌型溃疡病的症状，病原菌等做了相应解读。在众多杨树溃疡病种类中，研究较多的是水泡型溃疡病（Botryosphaeria dothidea），该病在杨树幼林上发生和危害较多，一般在感病品种上发病率达80%-100%，死亡率达30%-50%（黄烈健和苏晓华，2003）。该病常导致杨树整株树的枯死，造成严重危害和经济损失，如今已成为发展我国杨树人工林的严重障碍。其次是烂皮病，由金黄壳囊孢（Cytospora chrysosperma）引起的杨树烂皮病也呈现上升的势头（谷振泰，2008）。