摘 要

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是引起松树萎蔫病的病原,对我国松林资源造成极大破坏，其致病机理至今尚未彻底阐明。分子生物学的发展为松材线虫致病机理分析提供了新的技术手段。然而目前松材线虫分子生物学研究中所使用的材料都是未经标准化处理的混杂的野生型虫株，其遗传背景不清已经成为松材线虫分子机制研究中的重要制约因素。本项目首先开展了OKD-1、AMA3两个实验室保存株系的近交系培养工作,获得AMA3株系的近交系。以F6、F10、F15、F20四个不同近交代数的单条线虫材料，使用DNeasy kit提取单条线虫和群体（约1000条）线虫的DNA，采用SSR引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的检测发现群体线虫DNA和单条线虫DNA均有条带呈现，证明单条线虫DNA提取成功，因此采用单条线虫的DNA提取物作为后续实验材料。由于琼脂糖凝胶电泳的结果图呈现的条带不够清晰，故改用QIAGEN公司的毛细电泳技术。使用毛细电泳技术对28对SSR引物进行筛选，获得了12对扩增效果较好的特异引物。使用这12对引物对AMA3株系中F6、F10、F15、F20的单条线虫DNA提取物进行PCR扩增，其中11对引物扩增F6、F10、F15、F20分别为均一大小的条带，说明自近交第6代起，松材线虫已经达到较高的纯合度。该研究成果为日后近交系材料用于松材线虫分子遗传学研究提供可靠的理论依据。

关键词：松材线虫；近交系；SSR

Genetic structure of Bursaphelenchus xylophilus by using microsatellite DNA markers

ABSTRACT

Pine wilt disease is caused by Bursaphelenchus xylophilus ,which has devastated Pine Forest resources seriously，the pathogenic mechanism has not yet been completely understood. Development of molecular biology provides a new technique to discover this pathogenic mechanism. However, the B. xylophilus material used in molecular biology currently are mixed wild-type strains without standardization process, the unclear genetic background becomes an important constraint to the research on the molecular mechanism of B. xylophilus. This project firstly cultured OKD-1, AMA3 two laboratory preservated strains. Obtained AMA3 inbred strains, using F6, F10, F15, F20 four different single nematode material. Use DNeasy kit to extract single nematode and population (about 1000) nematode’s DNA. Different SSR primers’ pcr amplified products were tested by agarose gel electrophoresis. Population and single nematode’s DNA bands were presented proves that DNA are successfully extracted, so the single nematode DNA extract used as following experiments’ materials. However, the diagrams of agarose gel electrophoresis are not clear enough for accurate polymorphism analysis, so QIAGEN's capillary electrophoresis were choose. 12 specific polymorphism amplified primers were filtered from 28 SSR primers by using capillary electrophoresis. Use these 12 primers AMA3 lines in F6, F10, F15, F20 of a single worm PCR amplification of DNA extracts obtained polymorphic results. In which 11 pairs of primers F6, F10, F15, F20, respectively stripe uniform size, indicating that the sixth generation from inbreeding since the pine wood nematode has reached a higher homozygosity. These will provide a reliable theoretical basis for future inbred material pine wood nematode molecular genetics research.

Key words：Bursaphelenchus xylophilus；Inbred；SSR

目 录

1 前言 1

1.1松材线虫病研究进展 1

1.1.1 松材线虫病的病原 2

1.1.2 松材线虫病致病机理 2

1.1.3 松材线虫病的国内外研究 3

1.2 近交系动物研究现状 3

1.2.1 近交系动物的定义 3

1.2.2 实验动物的近交 3

1.2.3 线虫类近交系实验动物的培育 4

1.3分子标记技术 4

1.3.1 分子标记技术的概况 4

1.3.2 SSR分子标记技术 5

1.4 本研究的目的意义 6

2 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 供试松材线虫虫株 7

2.1.2生化试剂 7

2.1.3主要仪器设备 8

2.2 方法 8

2.2.1松材线虫的人工培养与获得 8

2.2.2 松材线虫近交系的建立 9

2.2.3 松材线虫的SSR分析 11

2.2.4 数据处理与统计分析 14

3 结果与分析 15

3.1 人工饲养松材线虫 15

3.2 松材线虫近交系建立 15

3.2.1 同步化松材线虫的培养 15

3.2.2松材线虫近交系的培育 16

3.2.3 近交系选择 17

3.3 松材线虫的SSR分析 17

3.3.1 DNA提取 17

3.3.2 琼脂糖凝胶电泳 17

3.3.3 DNA样本的选择 18

3.3.4 引物筛选 19

3.3.5 近交系遗传纯度检测 20

结论与讨论 23

致 谢 25

参考文献 26

1 前言

松材线虫起源于北美洲，并广泛分布于美国和加拿大，是一种松林入侵害虫。在起源地内，它是由一种天牛甲虫携带来进行传染。在二十世纪初，由于国际贸易的进行，通过木材、木制品和船上的箱子等途径，松材线虫传染到了其他大陆，并开始大量繁殖，造成松树萎蔫病。最终对全球范围内的针叶林造成严重威胁，其中最严重的是松树林。例如中国、韩国、日本等东亚国家，松树萎蔫病是最为严重的森林病害。1999年首次在葡萄牙的Setubal半岛发现松材线虫，随后又在葡萄牙的中心以及马德拉岛发生疫情，在这之后西班牙又爆发了新的疫情^[1]。

已有研究表明，松材线虫各种群间及种群内存在高度的遗传多样性，自然条件下线虫体表携带大量的细菌。因此，用普通条件下饲养的松材线虫做实验，存在敏感性较差，反应性不一致，实验结果不易重复等不足。尤其是在分子遗传学研究中，采用遗传背景不一致、微生物得不到控制的材料，可能会对结果的分析造成一定影响。要提高实验的准确性，必须对实验动物加以遗传学和微生物学控制。