虎纹蛙(Hoplobatrachus chinensis Osbeck) 微卫星引物的筛选与扩增毕业论文

 2021-04-20 11:04

摘 要

本文采用12对微卫星引物对3个虎纹蛙种群进行了扩增,结果显示,12对引物在虎纹蛙各个种群中均能扩增出清晰的单一条带。说明这12对引物在虎纹蛙中的特异性非常好,可以用于种群内的遗传多样性、遗传结构、基因流分析以及系统发生研究。

关键词:虎纹蛙;特异性;微卫星引物。

Research of screening and amplification of microsatellite primers of Hoplobatrachus Chinensis Osbeck

Abstract:In this paper, twelve pairs of primers were used to amplify the microsatellite of Hoplobatrachus Chinensis Osbeck. The result show that scorable and single amplification of DNA fragments were observed with 12 pairs of primers. The 12 pairs of primers in Hoplobatrachus Chinensis Osbeck is very good in specificity,Which can be used for population genetic diversity、genetic structure、gene flow analysis and system research.

Keywords: Hoplobatrachus chinensis Osbeck; Specificity; Microsatellite primers.

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目录

前言 4

1 材料和方法 5

1.1实验材料 5

1.2实验方法 5

1.2.1基因组DNA提取 5

1.2.2微卫星位点的筛选 5

1.2.3微卫星的扩增 5

1.2.4琼脂糖凝胶电泳 8

2 实验结果 8

2.1微卫星位点扩增结果 8

2.1.1 位点HR08的扩增结果 8

2.1.2 位点HR217的扩增结果 8

2.1.3 位点HR221的扩增结果 8

2.1.4 位点HR34的扩增结果 8

2.1.5 位点HR103的扩增结果 8

2.1.6 位点HR105的扩增结果 8

2.1.7 位点HR204的扩增结果 8

2.1.8 位点HR119的扩增结果 9

2.1.9 位点HR208的扩增结果 9

2.1.10 位点HR209的扩增结果 9

2.1.11 位点HR210的扩增结果 9

2.1.12 位点HR214的扩增结果 9

3讨论与结论 15

参考文献 17

前言

微卫星DNA意指广泛存在于真核和原核基因组中的一类短的、简单的、串连的重复序列,又称为短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列(Simple sequence repeats,SSRs)[1-2],由1~6个核苷酸组成,在脊椎动物中尤以二核苷酸重复序列(CA/GT)n最为常见。通常认为重复序列的产生是由于在遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换所致[3]

由于微卫星在水产动物的研究和应用落后于陆生动植物,已分离可利用的资源较少,而筛选大量的高效、多态、共显性标记是进行连锁图谱构建、QTL定位基因、分子标记辅助育种的基础,是繁琐而又必需的工作[4]

微卫星DNA标记具有数量多、等显性遗传、在基因组内分布均匀、多态性信息丰富,在不同基因位点上的微卫星 DNA 的重复顺序可以不同也可以相同,具有遗传连锁不平衡现象,并且微卫星DNA能进行特异的PCR扩增,其稳定性好,易于检测,因此目前被广泛应用于分子生物学及遗传学等研究领域[5],如:生物遗传作图、基因连锁与遗传图谱构建、遗传结构分析、基因流分析、种群结构分析、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测、物种鉴定以及个体间亲缘关系研究、鉴定有效种群大小分析、种群动态分析、系统地理学、保护遗传学等各个领域[6]

虎纹蛙(Hoplobatrachus chinensis Osbeck)分布于江苏、浙江、湖南、湖北、安徽、广东、广西、贵州、福建、台湾、云南、江西、海南、上海、河南、四川和陕西南部等地,在国外还见于南亚和东南亚一带。由于其个体大,肉质鲜美,长期以来是人们捕捉的对象,也是以前我国的出口土特产品,在市场上需求量甚大。近十几年来,由于生态环境的变化以及人们的过度猎捕,虎纹蛙数量已经日趋减少,资源近于衰竭,已被我国列为二级保护动物。开展对虎纹蛙种群结构、遗传多样性、保护生物学研究具有主要的意义,能为虎纹蛙遗传多样性研究奠定基础。

本文选择选择了合作指导老师实验室筛选出的20个位点对海南省海口市灵山镇(Hnls01-24)、江西省龙南县种群(Jxln01-24)、广东省佛山市三水区(Gdss01-24)等3个虎纹蛙种群进行了扩增,其中12个位点成功扩出,其它位点只有部分个体扩出或未扩出。

1 材料和方法

1.1实验材料

研究用虎纹蛙采自海南省海口市灵山镇(Hnls01-24)、江西省龙南县(Jxln01-24)、广东省佛山市三水区(Gdss01-24)。

1.2实验方法

1.2.1基因组DNA提取

(1)从标本后肢剪取适量的肌肉组织,在5mL冷冻管中用双蒸水脱醇,过夜,期间换水2-3次[7]

(2)将脱醇后的肌肉组织之余1.5mL离心管中,充分剪碎肌肉,加500μL裂解缓冲液(含0.2% SDS,0.05 M EDTA,0.01M Tris-HCl,pH=8.0)和10μL Proteinase K (20 mg/mL),55℃消化过夜。

(3)用BioFlux公司的dBIOZOL基因组DNA提取试剂抽提DNA,具体操作流程请参照该试剂的操作手册。

(4)抽提产物用300μL去离子水溶解,经1%琼脂糖电泳检测后,于-20℃或-30℃保存备用。

1.2.2 微卫星位点的筛选

经过检测,本实验选取了20对微卫星引物对3个虎纹蛙种群进行了扩增。其中12对引物成功扩出,其它位点只有部分个体扩出或未扩出。位点具体信息见表1。

1.2.3微卫星的扩增

微卫星扩增反应体系如下:

2×Taq PCR Master Mix

5μL

上下游引物(10μM)

各0.2μL

模板DNA

5-10ng(0.4μL)

diH2O

up to 10μL

Total

10μL

其中第二步到第五步重复29个循环,总计30个循环。PCR反应在Bio-Rad S1000型热循环仪上进行[8-9]

95℃

5min

95℃

30s

Tm

30s

72℃

45s

72℃

10min

15℃

forever

位点

引物序列

重复类型

退火温度(℃)

扩增产物(bp)

HR08

F:ACTAAACACTCCTCTGCGACCTG

(AC)12

60

204-232

R:CGGTTACTTTACCTTGTAGAATTGC

HR34

F:TCTATGTTTAGCTCCAATGCTGG

(CT)11

55

171-185

R:GCTCATGGCATCATACTCCTTTAGG

HR103

F:TAGGCAGATTTGTGGCATTT

(GT)16

55

283-329

R:AGAGGGATTCTCCTGTTATG

HR105

F:ATACAGACCTTGGTGGTAAGTTTT

(AC)10

55

278-328

R:GTTTATTCTATCAGTTAGTGGAG

HR119

F:AAAATGTAAAAAACGATTCTAATAG

(CA)27

58

228-244

R:TCCTTGTTTGACCCTCCCCTGCCCT

HR204

F:ATCCGCCGCTTATGACGAGG

(GA)15

55

252-278

R:CAGCCTGCTTAGAAGAAGAAA

HR208

F:TTGGTCTCAGCCTCCTAATCTCC

(TC)18

55

295-307

R:CGCATCCACTACCCTATTGTCTC

HR209

F:TCTCCACAGTTTCTATGGCACC

(GA)17

55

276-296

R:CGATGAGAACAAACAATAGGCT

HR210

F:TTTACTCTTCTTTACCTAACCCTG

(CT)22

55

261-269

R:GATGGCACAAAACACTACTCCC

HR214

F:AGAATGAAAAGAATAGTAGGGA

(AG)18

55

317-347

R:AGATTGTAAGAGGGAACAGTAGTCA

HR217

F:CTTTGTGGTTGTGGGATTTC

(GA)24

55

263-281

R:CTCAACTGTGAACCAGGATA

HR221

F:AGGCAGAACATAAAGACGCA

(GA)36

60

163-287

R:GCCAGCACATTGGGGTAGAG

表1 微卫星位点信息

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳

扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶检查,用凝胶成像系统紫外拍照[10]

2 实验结果

2.1微卫星位点扩增结果

2.1.1 位点HR08的扩增结果

HR08在Hnls01-24中有4个个体未扩增出来,在Jxln01-24、Gdss01-24中均全部扩出。

2.1.2 位点HR217的扩增结果

HR217在Hnls01-24、Jxln01-24、Gdss01-24中均全部扩增出。

2.1.3 位点HR221的扩增结果

HR221在Hnls01-24中有5个个体未扩出,在Jxln01-24、Gdss01-24中均全部扩增出。

2.1.4 位点HR34的扩增结果

HR34在Hnls01-24有1个个体未扩出,在Jxln01-24中全部扩增出来,在Gdss01-24中全部扩出。

2.1.5 位点HR103的扩增结果

HR103在种群Hnls01-24中有5个个体未扩增出来,在Jxln01-24、Gdss01-24全部扩增出来。

2.1.6 位点HR105的扩增结果

HR105在种群Hnls01-24中只有4个个体扩增出来,其它个体未扩出;在Jxln01-24中有8个个体未扩出;在Gdss01-24中全部扩增出。

2.1.7 位点HR204的扩增结果

HR204在Hnls01-24中有3个个体未扩出,在Jxln01-24中全部扩出,在Gdss01-24中全部扩增出。

2.1.8 位点HR119的扩增结果

HR119在Hnls01-24中有6个个体未扩出,在Jxln01-24中有6个个体未扩增出,在Gdss01-24中全部扩增出。

2.1.9 位点HR208的扩增结果

HR208在种群Hnls01-24、Jxln01-24中全部扩出,在Gdss01-24中有一半个体未扩出。

2.1.10 位点HR209的扩增结果

HR209在种群Hnls01-24、Jxln01-24、Gdss01-24中均扩增了出来。

2.1.11 位点HR210的扩增结果

HR210在Hnls01-24、Jxln01-24、Gdss01-24中均全部扩增出。

2.1.12 位点HR214的扩增结果

HR214在Hnls01-24、Jxln01-24、Gdss01-24中均全部扩出。

图1 HR08扩增电泳图谱

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