摘 要

真菌作为如今大多数植物发生病虫害的病原菌，而当今主要的杀菌或抑菌方法有化学法和生物法，生物法相比于化学法具有对环境友好的特点，因此利用生物法抑制这些病原菌生长的研究受到越来越多人的关注。真菌的细胞壁主要成分是几丁质，而分解它的专一性酶--几丁质酶也成为了大家研究的热点。本文采用粘质沙雷氏菌与七叶树壳梭孢的对峙实验、胶体几丁质透明圈实验，验证了几丁质酶的存在，然后再提取粘质沙雷氏菌的基因组DNA，进行PCR扩增，从中分离得到了控制几丁质酶生成的chiB基因。实验结果表明：(1)在对峙实验中，七叶树壳梭孢菌被粘质沙雷氏菌抑制生长。（2）在加有胶体几丁质的培养基中，粘质沙雷氏菌菌落周围出现明显的透明圈，显示出分解几丁质效果显著。（3）PCR扩增的序列进行比对分析后，同源性高达99%，证明该序列片段为chiB基因。

关键词：几丁质；几丁质酶；chiB基因；胶体几丁质；PCR扩增

A preliminary study on the antibacterial and life-promoting properties of a Serratia marcescens and its mechanism

ABSTRACT

Fungi are the pathogens of diseases and insect pests in most of today's plants. The main bactericidal or bacteriostatic methods today are chemical and biological methods, and biological methods are more environmentally friendly than chemical methods. Therefore, biological methods are used to suppress the growth of these pathogens. More and more people are paying attention. The main component of the cell wall of the fungus is chitin, and the specific enzyme that breaks down it, chitinase, has also become a hot spot for everyone to study. In this paper, the experiments of colloidal Serratia marcescens and Thielavia fuciformis were used to verify the presence of chitinase, and then to extract the genomic DNA of Serratia marcescens. PCR amplification was performed and the chiB gene controlling chitinase production was isolated. The experimental results show that: (1) In the counterflood experiment, Thielavia henryi was inhibited by Serratia marcescens. (2) In the culture medium with colloidal chitin added, a clear transparent circle appeared around the Serratia marcescens colony, showing that chitin was significantly decomposed. (3) After the alignment of the PCR amplified sequences, the homology was as high as 99%, demonstrating that the sequence fragment is the chiB gene.

Key words: chitin; chitinase; chiB gene; colloidal chitin; PCR amplification

目 录

一

1.粘质沙雷氏菌性状及分布 2

1.1粘质沙雷氏菌的应用 2

1.1.1灵菌红素的应用 2

2.粘质沙雷氏菌几丁质酶的应用 3

2.1几丁质酶的发现及研究历程 3

2.2粘质沙雷氏菌几丁质酶分子研究 3

3.粘质沙雷氏菌产2,3-丁二醇的研究 4

3.1 2,3-丁二醇理化性质、生产方法及应用 4

4.目的与意义 5

二

1.材料和方法 6

1.1材料 6

1.1.1菌株来源 6

1.1.2培养基 6

1.2仪器与使用试剂 6

1.2.1仪器设备 6

1.2.2使用试剂 6

1.3.方法 7

1.3.1沙雷氏菌抑菌作用的对峙实验 7

1.3.2几丁质酶的透明圈试验 7

1.3.3细菌基因组DNA的提取 8

1.3.4 chiB基因的PCR扩增 9

1.3.5验证2,3-丁二醇的V-P试验 9

2.结果与讨论 10

2.1、结果分析 10

2.1.1 沙雷氏菌抑制真菌作用 10

2.1.2几丁质酶透明圈试验 11

2.1.3 几丁质酶基因的克隆 11

2.1.4ChiB基因的序列测定 11

2.1.5 扩增片段与ChiB比对分析 12

2.1.6验证2,3-丁二醇的V-P试验 20

2.2讨论 21

参考文献： 22

致 谢 23

一

文献综述

从上世纪以来,由于某些病原微生物产生了抗药性，导致在农产品中施加的农药越来越多，农产品当中含有残留的农药也日益变多，从而引起了一系列环境污染问题，引发了大家的关注。而如今要解决问题的方法大多是化学法和生物法两种，相比于化学法，生物法利用的是微生物与其他生物之间存在着的多样关系，用一种或者多种微生物,来抑制病原物或者削弱其致病力，这是一种有效且对环境友好的方法。而目前研究的生物防治菌主要有假单胞菌、沙雷氏菌、放射性农杆菌等，真菌主要有酵母菌、木霉菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌等；而粘质沙雷氏菌由于其产物灵菌红素等在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌方面的突出作用从各种菌中脱颖而出，成为当前研究的热点之一。

1.粘质沙雷氏菌性状及分布

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ) 又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。它在形态上比一般其它肠道菌小，无荚膜，近球形短杆状，偶尔呈长丝状^{［1］［4］}，粘质沙雷氏菌广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。其最早在1823年被命名属于肠杆菌科，沙雷氏属的一个种，为革兰氏阴性短杆菌。

1.1粘质沙雷氏菌的应用

1.1.1灵菌红素的应用

灵菌红素是由多种微生物产生的一类具有多种生物活性的天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构。粘质沙雷氏菌能够产生这种红色色素，也即是灵菌红素。它对肿瘤细胞具有的抑制效果显著，在抑制的同时不会侵犯正常细胞，这让它有望成为一种新型的抗肿瘤和抗肿瘤转移药物^[5]。它因为具有这种抗肿瘤作用，所以在研究癌症方面，大家都把它作为重点研究对象；随着科学技术的发展，灵菌红素的研究不断深入，了解其抗肿瘤的机制，在癌症治疗中发挥作用^{［4］［18］}。灵菌红素也是一种天然色素，所以在色素利用方面又有另一番发展前景；并且有研究显示，灵菌红素对多种藻类，如微小平裂藻、蓝藻、新月菱形藻、中肋骨条藻、多环旋沟藻、水华鱼腥藻和等具有显著的杀灭作用，所以灵菌红素还具有杀灭藻类，防控水华和赤潮的能力。另外它还能抗真菌、抗细菌等^{［2］［7］}。