摘 要

本文对从连云港海滩分离提取的一株芽孢杆菌进行了鉴定分析，对它进行了生物学鉴定和活性分析。前期研究初步证明这株芽孢杆菌对美国白蛾具有一定的杀虫活性，为此，本研究对该株菌从菌落及显微形态、生理特性、分子等层面进行了相关鉴定和分析，并进一步对美国白蛾的生物学活性进行了验证和测定。结果显示，16srDNA序列与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）同源性达100%，菌落呈现沙质、干燥状，培养后期油镜观察有芽孢和球形、菱形晶体。进一步用cry1/7/9等引物进行PCR扩增，显示2号菌中存在cry基因。研究结果表明该菌为苏云金芽孢杆菌。用发酵液饲喂法对美国白蛾3龄幼虫进行了生物测定，结果显示，8小时致死率达80%，24小时致死率达100%，表明该菌具有较好的杀虫活性，为该菌进一步的生物防治应用打下了坚实的基础。

关键词：苏云金芽孢杆菌；生物学鉴定；杀虫活性；美国白蛾

Biological identification and activity analysis of a Bacillus

ABSTRACT

In this paper, a Bacillus strain isolated from Lianyungang beach was identified and analyzed, and its biological identification and activity analysis were carried out. Preliminary studies have preliminarily proved that Bacillus spore has a certain insecticidal activity to the American white moth. Therefore, this strain has been identified and analyzed from the microscopic morphology, physiological characteristics and molecular levels of the strain, and the biological activity of the American white moth was further verified and measured. The results showed that the homology of 16srDNA sequence and Bacillus thuringiensis was 100%, and the colonies were sandy and dry, and spores and spherical and rhombic crystals were observed by oil microscope at the later stage of culture. Further amplification of PCR by cry1/7/9 and other primers revealed that cry gene existed in No. 2 bacteria. The results showed that the strain was Bacillus thuringiensis. The bioassay of 3 instar larvae of the American white moth was carried out by the fermentation broth feeding method. The results showed that the mortality rate of 8 hours was 80%, and the mortality rate of 24 hours was 100%. It showed that the bacteria had good insecticidal activity and laid a solid foundation for the further biological control of the bacteria.

关键词：苏云金芽孢杆菌 生物学鉴定 杀虫活性 美国白蛾

Key words: Bacillus thuringiensis；biological identification,；insecticidal activity,；Hyphantria cunea

目 录

1 文献综述 1

1.1 生物防治 1

1.3 苏云金芽孢杆菌 1

1.4 苏云金芽孢杆菌的鉴定 2

1.5 苏云金芽孢杆菌的杀虫活性 2

1.6 苏云金芽孢杆菌cry基因 3

1.7 目的与意义 4

2 材料与方法 6

2.1材料 6

2.2 方法 6

2.2.1 菌株形态观察 6

2.2.2 基因组的提取 7

2.2.3 琼脂糖凝胶电泳 7

2.2.4 16srDNA鉴定 7

2.2.5 系统发育树的构建 8

2.2.6 cry基因的鉴定 8

2.2.7 室内杀虫活性测试 8

2.2.8 美国白蛾的表面消毒和体内筛菌 9

3 实验结果 10

3.1 菌落形态 10

3.2 2号菌菌株形态特征 10

3.3 DNA提取结果 11

3.4 16srDNA的结果 11

3.5 比对结果 12

3.6 系统发育树结果 13

3.7 cry基因检测结果 13

3.8 室内杀虫活性测试结果 13

3.9 活性测试结果检验 14

4 讨论 16

致 谢 18

参考文献 19

1 文献综述

生物防治

农林业病虫害严重损害林木作物的健康生长，是威胁林木和农作物安全的重要因素之一。目前应对农林业病虫害的主要方法为化学防治，但长期使用化学农药会使害虫产生抗药性使其更加难以杀灭，并且化学药剂会对环境造成很大危害。生物防治是指利用生物物种之间的相互关系，以一种或者一类生物抑制另一种或另一类生物的方法，目前生物防治大致可以分为捕食性天敌防治、寄生性天敌防治和微生物防治三大类。利用生物防治病虫害,能有效地避免这些问题,因而生物防治具有广阔的发展前途。

1.2 美国白蛾

美国白蛾（Hyphantria cunea） 是世界性检疫害虫。主要危害果树行道树观赏树木，尤以阔叶树危害严重，对农作物林木果树等造成了严重的危害，目前已被列入我国首批外来入侵物种。其食性较杂，对300多种植物都有危害。最严重的一次灾情发生在1984年陕西杨凌的一个飞机修理厂。近400亩厂区所有法国梧桐和杨树的树叶都被吃光，虫子还跑到职工家里，窗体底端天花板、墙角、炉灶、床，无所不在。1995年，美国白蛾虫灾在天津塘沽再次暴发。当时市民出行必须打伞，以防止幼虫掉进脖子里。天津市政府的一份报告说，虫灾发生的地区有6成的叶子被吃光，原本翠绿的街道变成了灰色。近年来，美国白蛾又呈现出爆发的势态，2017年，江苏省涟水县美国白蛾疫情扩散范围大、灾情重；平均有虫株率达52.3%，部分调查样地有虫株率高达100%，远远高于美国白蛾成灾标准数倍；在部分危害重的乡镇地面随处可见美国白蛾老熟幼虫，有的甚至爬到居民家中，给百姓生活带来了极大困扰。

1.3 苏云金芽孢杆菌

芽孢杆菌是一种能形成芽孢的杆菌或者球菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、苏云金芽孢杆菌属等。芽孢杆菌由于产生内生孢子,对于外界环境具有较强的抵抗力,对于其所生存环境中的干燥。紫外线辐射伤害和热具有抵抗力并且能让自己免受影响,这样的生物学特征使芽孢杆菌具有非常良好的应用前景,例如使用活菌制剂的生物制品，很多生物农药是利用芽孢杆菌制成的,尤其是苏云金芽孢杆菌，苏云金杆菌生产的伴胞晶体在农林业上是有效的生物杀虫剂,目前已成为世界上使用量最大的生物农药。

目前已知的苏云金芽孢杆菌亚种有以色列亚种，库斯塔柯亚种，科莫尔亚种，加拿大亚种等九个亚种。苏云金芽孢杆菌的母细胞会在形成芽孢的同时伴随着形成晶体蛋白，称之为伴胞晶体，伴胞晶体呈现立方体、球形、菱形、镶嵌形、无定形，是具有杀伤活力的杀虫晶体蛋白^[1]。它的伴孢晶体由一种或多种对昆虫具有专一毒性的蛋白质即δ内毒素组成。因为苏云金芽孢杆菌具有良好的特异性杀虫活性，效果好还不污染环境，苏云金芽孢杆菌已经成为目前最有效的生物杀虫剂。目前已知苏云金芽孢杆菌对鳞翅目、鞘翅目等九个目的昆虫和螨虫、植物线虫、原生动物、扁形动物等有特异性杀虫活性。

1.4 苏云金芽孢杆菌的鉴定

现在的研究已经可以将苏云金芽孢杆菌分为不同亚种、变种、血清型、晶体基因型。分类鉴定方法主要包括16srDNA分子鉴定，生理生化试验、酯酶法、晶体抗原法、鞭毛抗原法等。