摘 要

杨树黑斑病作为一种严重的杨树病害，会使患病杨树出现光合速率下降以及提前落叶的现象，严重影响树木的生长和营养储备，从而带来大量的经济损失。经研究发现，在我国有3种病原菌能引起杨树黑斑病，其中杨生褐盘二孢菌是引起杨树黑斑病的主要致病病原，近期我们针对其中一个单孢分离菌株NL1进行了全基因组测序。通过初步的生物信息学分析发现，其具有200-300个效应因子候选基因。在本研究中，我们拟定对部分候选基因进行克隆并构建到植物表达载体之上，将目的基因导入细胞，利用烟草的瞬时表达系统，分析活性氧爆发情况，筛选出抑制活性氧爆发的效应因子。在病原真菌侵染宿主植物过程中这些效应因子承担了重要作用，通过对他们的研究能更深入的了解植物天然免疫系统，为有效防治杨树黑斑病提供可行的方案。

关键词：杨树黑斑病；植物天然免疫系统；效应因子；植物表达载体

Cloning and Analysis of Candidate Effector of M.brunneaf . sp. monogermtubi

ABSTRACT

As a serious poplar disease，poplar black spot disease will decrease poplar’s photosynthetic rate and premature defoliation.It will seriously affect the growth and nutrition of trees and bring huge economic losses.The study founds that there are three kinds of pathogenic bacteria in China can cause black spot of poplar, Marsonina brunnea is the main pathogenic pathogen causing poplar black spot, recently we conducted one of the single spore isolates NL1 whole genome sequencing. A preliminary bioinformatics analysis revealed that it has 200-300 candidate genes for effectors. In this study, we proposed to clone some candidate genes and construct them on plant expression vectors, introduce the target genes into cells, use the tobacco's transient expression system to analyze the outbreak of reactive oxygen species, and screen out the effectors that inhibit reactive oxygen bursts. . These effectors play an important role in the process of pathogenic fungi infecting host plants. Through their research, we can better understand the plant's natural immune system and provide a feasible solution for the effective control of poplar black spot.

Key words：poplar black spot disease,plant immune system,effector,plant expression vector

目 录

1 前言………………………………………………………………………………………..........................1

1.1 杨树黑斑病概况……………………………………………………………….................................1

1.2 植物免疫系统…………………………………………………………………………...................1

1.2.1 植物病原微生物…………………………………………………..........................................2

1.2.2 植物天然免疫系统…………………………………………………......................................2

2 载体的构建………………………………………………………………………………..........................3

2.1 前期准备……………………………………………………………………...................................3

2.1.1 酶切质粒pENTR/D………………………………………………….....................................3

2.1.2 种植烟草…………………………………………………....................................................3

2.2 实验过程…………………………………………………………………………...........................3

2.2.1 PCR扩增…………………………………………………...................................................3

2.2.2 凝胶电泳检测条带…………………………………………………...................................3

2.2.3 扩增产物纯化…………………………………………………...........................................3

2.2.4 酶切PCR纯化产物………………………………………………………………………..4 2.2.5 切胶回收……………………………………………………………………............………………4

2.2.6 连接……………………………………………………………………............…………..4

2.2.7 转化……………………………………………………………………............…………..4

2.2.8 接种菌株……………………………………………………………………......................4

2.2.9 挑菌……………………………………………………………………............…………..4

2.2.10 菌液PCR…………………………………………………………………….....................4

2.2.11 转化……………………………………………………………………............................5

2.2.13 诱导…………………………………………………………………………………........5

2.2.14 注射烟草………………………………………………………………………..............5

2.2.15 活性氧的爆发………………………………………………………………………......5

3 结果与分析………………………………………………………………………………........................6

3.1 第一次DNA扩增后检测条带……………………………………………………………………6

3.2 菌液PCR扩增后检测带………………………………………………………………………...6

3.3 活性氧爆发检测…………………………………………………………………………............7

结论………………………………………………………………………………………………………...9

致谢………………………………………………………………………………………………………10

参考文献…………………………………………………………………………………………………11

1 前言

1.1 杨树黑斑病概况

杨树是杨柳科的一类较为常见的国家特别培养的树种，也是世界上分布最广、适应性最强的一类树种。其生长速度非常快，一般来说几年就可以长成为高大乔木，且树干笔直，因此用途十分广泛，经济价值非常高。但是近几年，杨树的病害日益成为一个热点话题，其中杨树黑斑病发病范围最广、危害最大。杨树黑斑病又称杨树褐斑病，能导致杨树树叶大量脱落，幼树大量死亡，直接影响植物的光合作用，破坏树木的生长和营养储备，造成巨大的经济损失。因此对杨树黑斑病的研究与治理，已经成为植物学研究的一个重要课题。

在我国有3种病原菌能引起杨树黑斑病，分别是杨盘二孢菌、白杨盘二孢菌和杨生褐盘二孢菌。不同的病原菌引起的黑斑病症状在病斑形成的位置和病斑的形状等方面都不相同。其中，杨生褐盘二孢菌是引起杨树黑斑病的主要致病病原，属半知菌亚门、腔抱纲、黑盘菌目、盘二孢属，是一种丝状真菌。我国的杨生褐盘二孢菌，存在2种专化型即单芽管专化型和多芽管专化型。他们对杨属不同派别致病力不同，多芽管专化型主要寄生在黑杨、青杨上，单芽管专化型主要寄生在白杨上。此外，其分生孢子萌发时所产生的芽管数量也不同。