杨树粗线期染色体制片及原位杂交体系研究毕业论文

 2021-04-20 11:04

摘 要

本文以美洲黑杨无性系‘哈佛杨’为研究对象,取其处于减数分裂粗线期的花絮固定,酶解后通过比较蒸汽滴片法、涂片法、压片法及改良压片法,获得了高质量的美洲黑杨粗线期染色体制片;然后以拟南芥端粒序列为探针,采用缺刻平移法用地高辛标记探针DNA,杂交后信号用Rodamine anit-DIG-sheep抗体检测,得到了地高辛标记的端粒序列杂交信号。结果表明:改良压片法是高效获得高质量美洲黑杨粗线期染色体的制片方法,获得的制片背景干净,染色体形态良好,常染色质与异染色质区别明显,适于进一步荧光原位杂交研究;而得到的端粒序列杂交信号中多数染色体的端部都有清晰的端粒序列杂交信号,部分染色体端部未见信号,分析认为可能由于粗线期染色体较长,染色体在压片过程中断裂的缘故。

关键词:美洲黑杨;粗线期染色体;荧光原位杂交

Research on chromosome preparation and in situ hybridization system of Populus deltoides Marsh

ABSTRACT

This thesis is taking the clones of Populus deltoides' Harvard Yang as the object of study. Fix tidbits which are in Meiosis Pachytene, and after enzymolysis get high quality preparation of Populus deltoides pachytene stage chromosome by the method of comparing the vapor drop plate, smear pressed method and modified compression; And then taking Arabidopsis type telomeric sequences as a probe, using the method of nick translation to lable DNA probe with digoxigenin, signal was detected by anit-DIG-sheep antibody to get the hybridization signal of telomere sequence labeled by digoxigenin. The results showed that the method of improved compression is efficient to obtain high quality of Populus deltoides pachytene chromosome preparation.The background was clean, chromosome morphology is good, the difference between euchromatin and heterochromatin is obvious, the preparation is suitable for further studies based on fluorescence in situ hybridization; the telos of most chromosomes having hybridization signals of telomere sequence have the clear hybridization signals of telomere sequence, part of the chromosome telos have no signal and analysis shows that chromosome breaks in the compression process because of the longer pachytene chromosomes.

Key words:Populus deltoides;Marsh; Pachytene chromosomes; Fluorescence in situ

Hybridization

目 录

1 前言 1

2 材料和方法 2

2.1 实验材料 2

2.2 实验方法 2

2.2.1 花枝采集及培养 2

2.2.2 花芽采集及固定 2

2.2.3 粗线期染色体制片 2

2.2.4 粗线期染色体荧光原位杂交 3

3 结果及讨论 3

3.1 不同方法的制片效果 3

3.2 荧光原位杂交技术体系 4

致 谢 6

参考文献 7

1 前言

杨树由于其自身的生物学特性及其重要地位而成为林木研究的模式树种。模式植物的重要遗传学研究平台主要包括细胞学图谱、遗传连锁图谱、物理图谱及全基因组测序。杨树代表性的遗传连锁图谱是2004年美国能源部橡树岭国家实验室发表的与染色单体数相对应的、覆盖全基因组的遗传连锁图谱[1]。2007年,加拿大基因组中心和美国能源部橡树岭国家实验室联合发表了杨树的物理图谱[2]。2006年, 美国科学杂志报道了毛果杨无性系“Nisqually-1”全基因组测序的研究结果[3]。然而,与杨树模式树种研究所不匹配的是,杨树的细胞遗传学研究滞后,国内外还没有一张高分辨率细胞学图谱供研究使用。

杨树由于其染色体较小,依据有丝分裂中期染色体的形态难以准确辨别每条染色体,导致细胞遗传学研究明显滞后。已有的研究主要集中在染色体计数、染色体形态及减数分裂过程中染色体行为观察等方面。1924年,Harrison 的研究结果证明杨树的染色体基数为19。随后的研究显示,多数杨树是二倍体(2n=38),只有少数白杨派或种间杂交后代是三倍体或4倍体[4-7]。国内学者对杨树减数分裂及其进程进行了大量研究,建立了部分杨树花序外观形态与减数分裂进程的对应关系,为杨树的倍性育种奠定了基础[8-11]。董凤平、胡宝全等对杨树有丝分裂中期染色体进行了荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)研究[12-13],对部分杨树进行了初步核型分析。有关杨树粗线期染色体方面的研究国内外还未见报道。

美洲黑杨 (Populus deltoides Marsh)是北美洲的重要森林树种,具有速生, 干直, 抗病虫等优点。20世纪70年代初,南京林业大学引进了一批美洲黑杨无性系。目前,美洲黑杨优良无性系已在我国大范围推广种植, 成为我国重要的速生工业用材树种及杨树杂交育种的重要亲本来源。美洲黑杨及多数杨树有丝分裂中期染色体几乎成点状,即使在高倍油镜下观察,也很难区分19对不同的染色体。减数分裂粗线期染色体是有丝分裂中期染色体的10-40倍长,可以弥补有丝分裂中期染色体小的缺陷,但粗线期染色体是减数分裂的一个阶段,加上小孢子母细胞细胞质浓厚,取材和制片及荧光原位杂交难度远远大于有丝分裂中期染色体。本研究以美洲黑杨无性系‘哈佛杨’为研究材料,通过比较不同制片方法,以获得高质量粗线期染色体并建立荧光原位杂交技术体系,旨在为进一步开展杨树的分子细胞遗传学研究奠定工作基础。

2 材料和方法

2.1 实验材料

材料为美洲黑杨无性系哈佛杨(P. deltoids Bartr. cv.‘Harvard’)的花枝,该无性系为雄株,于1972年由南京林业大学引自意大利杨树所,即I-63杨,由于引自意大利,故常称之为意大利杨,简称意杨。实验材料采自南京林业大学校园内。

2.2 实验方法

2.2.1 花枝采集及培养

2015年2月9日采集生长良好的美洲黑杨雄花枝,每个枝条长约1~1.5 m,将花枝置于室外自然环境下水培,每隔2天换一次干净的自来水,每天观察花芽的外部形态变化。

2.2.2 花芽采集及固定

花芽顶端及侧面的芽鳞开始松动时,采摘花芽,剥去芽鳞后将整个雄花序固定于卡诺固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1),室温固定12小时后置于4℃冰箱保存。

2.2.3 粗线期染色体制片

分别采用蒸汽滴片法[14]、涂片法[15-16]、常规压片法及改良压片法制片。改良压片法与常规压片法相比主要不同点为:在50-52℃热台上压片而不是常温下制片,盖玻片不用液氮揭除而是在载玻片一侧滴加45%乙酸,使盖玻片自然滑落。

2.2.4 粗线期染色体荧光原位杂交

端粒序列DNA为美国威斯康辛麦迪逊大学Jiming Jiang 教授惠赠。探针制备、染色体制片的预处理及杂交液配制参考房磊等[15]及Gao Tingting等[17]描述的方法。杂交后染色体制片的漂洗步骤为:2×SSC室温洗5min;2×SSC42℃洗10min;1×TNB室温洗5min。杂交信号的检测步骤为:每张制片用100μl 1×TNB混合抗体(Rodamine anit-DIG-sheep);盖上盖玻片,37℃避光保温1h;1×TNB室温洗3次,每次5min;1×PBS室温洗5min;每张制片用20μl 含有DAPI的封片胶封片。Olympus BX51型荧光显微镜下观察拍照。

3结果及讨论

3.1 不同方法的制片效果

传统的染色体制片方法是压片法,该法是将固定的材料经过纤维素酶及果胶酶或乙酸解离后用45%乙酸压片,显微镜下观察染色体分裂相良好的制片用液氮揭片。随着细胞遗传学的发展,制片方法也在不断创新,目前常用的方法除压片法外,主要有涂片法、(蒸汽)滴片法及火焰干燥法。实践表明,不同的制片方法各有其优缺点,加之不同实验材料的差异,在开展分子细胞遗传学研究时要针对实验材料筛选合适的制片方法,以获得染色体形态良好,制片背景干净的高质量染色体制片。小孢子母细胞由于细胞质浓厚,粗线期染色体的制片难度要远远大于有丝分裂中期染色体。本文通过比较蒸汽滴片法、涂片法、压片法及改良压片法,获得了高质量的美洲黑杨粗线期染色体制片。

蒸汽滴片法要将花药充分酶解,通过TE和乙醇重悬细胞,将合适浓度及体积的重悬细胞滴加在载玻片上,再加卡诺固定液,用55℃左右的热蒸汽使染色体分散[14]。该法较难获得高质量美洲黑杨粗线期染色体,可能是因为用TE和乙醇重悬细胞时,损失了大量的分裂相;涂片法是将充分酶解的花药,置于载玻片上,滴加60%的乙酸,在55℃左右的热台上将花药组织均匀涂布在载玻片上,随后用卡诺固定液冲洗[15-16]。该法可以获得较多的美洲黑杨粗线期染色体,但染色体DAPI着色较差。这可能是60%的乙酸对染色体的着色产生了影响;常规压片法获得的制片中也有大量粗线期染色体,但背景较深,会对下一步的荧光原位杂交信号产生干扰。而且制片时敲裂的盖玻片对液氮揭片也会产生明显影响,因此,采用常规压片法较难获得高质量美洲黑杨粗线期染色体制片;改良压片法是在50-52℃热台上压片,这样乙酸可以更好的解离果胶质并软化细胞壁。在载玻片一侧滴加45%乙酸使盖玻片自然滑落,滴加的乙酸在流动过程中可以带走大量细胞碎片,起到很好的冲洗分裂相的目的,所以获得的粗线期染色体制片背景干净,适于染色体分析研究。盖玻片自然滑落省去了液氮揭片的步骤,敲碎的盖玻片对揭片没有影响。综合分析认为,改良压片法是高效获得高质量美洲黑杨粗线期染色体的制片方法,获得的制片背景干净,染色体形态良好,常染色质与异染色质区别明显(图1),适于进一步荧光原位杂交研究。

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