杨树花粉母细胞减数分裂过程观察

摘　要

以美洲黑杨的雄花枝为材料，采用室外常温切枝水培和卡宝品红压片法，观察花粉母细胞减数分裂进程与花芽及花药外观形态的关系。结果表明：花序开始露出芽鳞之前减数分裂已经结束，花芽顶端及侧面的芽鳞开始松动时，在同一花序中可以观察到从小孢子母细胞到花粉粒的所有减数分裂阶段，此时是诱导2n配子的最佳时期；美洲黑杨花药长度与减数分裂阶段密切相关，长约0.5mm的花药处于减数分裂的小孢子母细胞阶段，长约1.0mm的花药处于减数分裂的细线期、粗线期、中期Ι、末期Ι及二分体阶段，长约1.5mm的花药处于减数分裂的四分体时期，长约2.0mm的花药已处于花粉粒阶段；同一花枝上的不同花芽及同一花序中不同小花的发育不同步，但同一小花中的不同花药发育基本一致。美洲黑杨减数分裂过程中染色体行为正常，花药数量巨大，是分子细胞遗传学研究的良好实验材料。

关键词：美洲黑杨；小孢子母细胞；减数分裂

Observation the meiosis processes of the pollen mother cells in poplar

ABSTRACT

In this study，relations between the meiosis processes of microsporocytes and morphology of male flower buds and anthers in Populus deltoides Marsh were studied with water culturing detached floral branches outdoor and carbol fuchsin staining. The results were as follows: The meiosis had ended before the catkin came out of the bud scale. When the bud scale from the top or lateral of the flower bud began to loose， all the meiosis processes can be found from the same flower bud ，and this was the best time to induce 2n gametes; There was a close relationship between the length of anthers in Populus deltoides Marsh and stages of meiosis.The 0.5mm long anther was in the stage of microsporocytes，the 1.0mm long anther was in the stage of leptotene、pachytene、metaphase I、telophase I and dyad， the 1.5mm long anther was in the stage of tetrad， the 2.0mm long anther was in the stage of pollen; Different flower buds in one flowering branch or different florets in one flower bud showed non-synchronization in the meiosis processes of microsporocytes， but different anthers in one floret showed synchronization in the processes. During the meiosis processes of microsporocytes in Populus deltoides Marsh，the chromsomes were normally behaved with large amounts of anthers，which is a good experimental material for molecular cytogenetic study.

Key words: Populus deltoides Marsh; microsporocyte; meiosis

目　录

1　前　言 - 1 -

1.1 杨树种质资源概况 - 1 -

1.2 杨树育种研究进展 - 2 -

1.3 杨树细胞学研究进展 - 2 -

1.4研究目的与意义 - 3 -

2　材料和方法 - 4 -

2.1 实验材料 - 4 -

2.2 实验方法 - 4 -

2.2.1 花枝采集及培养 - 4 -

2.2.2 小孢子母细胞减数分裂过程观察 - 4 -

2.2.3 花粉萌发率测定 - 4 -

3　结果与分析 - 6 -

3.1 水培花芽的生长发育 - 6 -

3.2 小孢子母细胞发育进程与花芽及花药外观形态的关系 - 7 -

3.3 不同减数分裂阶段的细胞学特征 - 7 -

讨　论 - 9 -

致　谢 - 11 -

参考文献 - 12 -

1　　前　言

杨树是重要的用材树种，并在城市道路绿化中具有防沙滞尘功能，因此也是园林绿化的首选树种。而美洲黑杨(Populus deltoides Marsh)是北美洲的重要森林树种，自然分布于北美洲北纬30°—50°的密西西比、俄亥俄、密苏里大河河谷及其支流沿岸冲积平原地带，具有速生，干直，抗病虫等优点。20世纪70年代初，南京林业大学引进了一批美洲黑杨无性系。通过30多年的栽培选择和区域化试验，选育出部分优良美洲黑杨无性系，该无性系在我国黄淮、江淮及长江中下游等平原地区表现出速生，抗病，材质好等优良特性^[1]。目前，美洲黑杨优良无性系已在我国大范围推广种植成为我国重要的速生工业用材树种及杨树杂交育种的重要亲本来源^[1-2]。

1.1 杨树种质资源概况

杨树是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.)树种的统称，杨属植物由于具有基因组构成精简〔单倍体(n=19)约含500±20Mbp〕。物种丰富，分布广泛；遗传转化容易，再生能力强，易于无性繁殖；已构建相对饱和的各种连锁图，获得大量与目标性状相关的分子标记等生物学特性，成为研究木本植物的首选模式物种。全属共有100余种，多分布于北半球温带，包括欧亚大陆、北美及北非，但主要集中在北纬30°—72°之间^[3]。中国是世界杨树集中分布区之一，种质资源十分丰富，包含5大派53种，特有35种传统上杨属树种一般可分为5大派，即白杨派(Sect Leuce Duby)、大叶杨派(Sect Leucoides Spach)、青杨派(Sect Tacamahaca Spach)、黑杨派(Sect Aigeiros Duby)和胡杨派(Sect Turanga Bge)^[2]。白杨派适应性较强，在温带和寒带的大陆性气候、海洋性气候区都可见白杨派树种的生长，其根蘖繁殖能力强，耐干旱和瘠薄。黑杨派分布于温带、亚热带地区，喜欢肥沃湿润、排水良好的疏松土壤，主要代表种为欧洲黑杨(Populus nigra L.)和美洲黑杨(Populus deltoides Marsh)。青杨派是包含树种最多的一派，分布于寒带和温带，有广泛的气候适应性和地理替代性。大叶杨派分布于温带的中高山地区，在我国多见于中部和西部地区。胡杨派适合干旱的大陆性气候，对阳光和气温要求很高，是干旱内陆河流沿岸分布的树种^[4]。

1.2 杨树育种研究进展

在我国林木杂交育种中，杨树杂交育种研究工作开展较早^[5]。1946年，叶培忠先生首次进行了杨树杂交试验^[6]。在众多的杨树杂交组合中，派内种间杂交以白杨派、黑杨派成就显著，派间杂交以青杨派与黑杨派杂交成果最为突出。从杂交方式看，有单交、双交、三交、回交等，以杂种作亲本进行再杂交能够获得显著杂种优势；从育种目标看，有速生、抗寒、抗旱、抗病虫、窄冠、生根等；从育种方法看，以常规人工杂交为主，将常规人工杂交与物理辐射、化学诱导等技术有机结合，能够创造出生产潜力较大的三倍体新品种^[7]。

三倍体杨树较二倍体杨树在速生、抗病及材质等方面具有显著优势，利用2n配子是培育三倍体杨树的重要途径^[8]。这主要因为2n配子不仅可以提高杂种倍性，而且可以传递杂合性和上位性，具有特殊的育种价值。因此，2n配子被视为在杂交育种过程中获得所期望性状渐渗最有希望的途径^[9-10]。不同种杨树天然产生2n配子的概率不同，但普遍较低，远远不能满足杨树遗传改良的需要。育种实践中通常采用物理（温度、辐射）或化学方法（秋水仙素、黄草硝）人工诱导2n配子发生，选择花芽发育的最佳诱导时期，是成功获得2n配子的关键因素之一。

1.3 杨树细胞学研究进展

杨树基因组具有高度的杂合性，其减数分裂过程往往伴随着复杂的染色体行为。目前，有关杨树细胞遗传学的研究相对比较滞后，主要集中在染色体计数、染色体形态及生殖分裂过程中染色体行为等方面^[11,13]。鲁敏^[15]等采用醋酸洋红压片法对响叶杨小孢子母细胞减数分裂进程中的染色体行为进行了研究，发现同一花芽的不同部位，减数分裂进程较不同步，并推断这种不同步性是响叶杨适应环境的一种进化表现。康向阳^[16-17]等采用细胞遗传方法对毛白杨花粉母细胞减数分裂及其进程进行了研究，发现其减数分裂进程有一定的规律，与花序的形态和花药颜色变化有密切相关，同时首次将细胞学技术与白杨花粉染色体加倍技术结合起来，较为准确地掌握了花粉染色体加倍的有效处理时期。王君^[18]等对通辽杨花粉母细胞减数分裂进程及其染色体行为进行了研究，发现在减数分裂过程中核仁数目存在1～8个的动态变化，这种现象可能与杨属植物古多倍性起源有关，并推测通辽杨染色体组内至少存在8对带有次缢痕的染色体。

1.4研究目的与意义

杨树由于其自身的生物学特性及其重要地位而成为林木研究的模式树种^[11]。杨树由于其染色体较小^[12]，依据有丝分裂中期染色体的形态难以准确辨别每条染色体，导致细胞遗传学研究明显滞后。减数分裂粗线期染色体是有丝分裂中期染色体长度的10-40倍^[24]，采用杨树粗线期染色体开展分子细胞遗传学研究，可以弥补染色体小的缺陷。近年来，快速发展的分子细胞遗传学技术及杨树的基因组信息，已为开展杨树的分子细胞遗传学研究提供了新机遇。已报道的有关杨树减数分裂过程的研究表明，不同种杨树减数分裂进程差异显著^[14-24]，而美洲黑杨减数分裂进程的研究还未见文献报道。本研究以美洲黑杨无性系‘哈佛杨’为研究材料，首次建立‘哈佛杨’的小孢子母细胞减数分裂进程与花药及花芽外观形态的对应关系，旨在为‘哈佛杨’2n配子的诱导及减数分裂粗线期染色体的获取奠定细胞学基础。

2　　材料和方法

2.1 实验材料

材料为美洲黑杨无性系哈佛杨（P.deltoids Bartr.cv‘Harvard’）的花枝，该无性系为雄株，于1972年由南京林业大学引自意大利杨树所，即I-63杨，由于引自意大利，故常称之为意大利杨，简称意杨。实验材料采自南京林业大学校园内。

2.2 实验方法

2.2.1 花枝采集及培养

2015年2月9日采集生长良好的美洲黑杨雄花枝，每个枝条长约1~1.5 m，将花枝置于室外自然环境下水培，每隔2天换一次干净的自来水，每天观察花芽的外部形态变化。

2.2.2 小孢子母细胞减数分裂过程观察

采用卡宝品红压片法观察小孢子母细胞减数分裂过程。具体操作为：剥去花芽外部的芽鳞，用眼科镊子取出花序中部的小花，然后随机取小花中10个左右的花药置于载玻片上，加15-20μl卡宝品红染色30s后压片，制片过程中避免花药失水。Olympus BX51型光学显微镜下观察拍照。花药形态采用Leica MZ 9.5 型体式显微镜观察拍照。

2.2.3 花粉萌发率测定

花粉萌发培养基为：100g/L蔗糖，20mg/L硼酸，20mg/L氯化钙，pH=5.8。花序散粉后，收集新鲜花粉测定萌发率。具体方法为：在有凹槽的载玻片上加100μl花粉萌发培养基，将少量花粉轻轻撒到花粉萌发培养基上，25℃保湿培养5h左右，Olympus BX51型光学显微镜下观察拍照。花粉萌发率的计算是随机统计5个视野，取其平均值。

3　　结果与分析

3.1 水培花芽的生长发育

花芽水培前外部形态如图1中的A-a，此时花芽直径较细。水培的第一个月即2月9日到3月9日间，花芽外观基本没有变化，这是因为环境温度较低，减数分裂基本处于停滞状态。3月10日以后，花芽开始逐渐膨大变粗，随着环境温度的提高，花芽膨大速度加快，到3月20日，可观察到部分花芽的芽鳞出现明显松动（图1，A-b），接着花序逐渐露出芽鳞，并慢慢伸长，花序上露出芽鳞的花药颜色由嫩绿色变为红色，最后花序散发大量花粉。水培的花芽与生长在母株上的花芽发育基本一致，说明水培不能加速花芽发育，温度条件对花芽的发育可能起关键作用。无论是水培的花枝或生长在母株上的花枝，同一花枝上不同花芽的发育速度有一定差异，这种差异使美洲黑杨散粉时间得到延长。