摘 要

本研究在已有的SSR分子标记技术基础上，运用12对多态性高的引物，对92个美洲黑杨无性系（品种）植株进行ABI3730毛细管电泳操作，共得到99个多态性位点。在这12对引物中，鉴别能力最强的是NJFUP-poly04，可直接鉴别29个美洲黑杨（无性系）品种，鉴别能力最弱的是NJFUP-poly08和NJFUP-poly11。利用这92个无性系（品种），完成了各个引物扩增位点的不同基因型频率的测算，并构建了多态性较高的10对微卫星引物扩增的标准指纹图。本研究旨在通过研发微卫星品种鉴定技术,形成一套真实、简便、快速、可靠的美洲黑杨无性系（品种）的分子鉴定技术体系，为杨树产业的健康和可持续发展提供关键技术支撑，同时为今后杨树资源的进一步开发利用提供理论依据和指导。

关键词：美洲黑杨；SSR分子标记技术；遗传鉴别；DNA图谱

Study on genetic identification of clones（varieties）of

Populus deltoides Marsh.

Abstract

On the basis of SSR molecular marker technique, 12 pairs of primers were used by ABI3730 capillary electrophoresis on plant 92 clones (varieties) of Populus deltoides Marsh, and finally 99 polymorphic loci were got. In the 12 pairs of primers, the strongest identification was NJFUP-poly04, which can identify 29 clones （varieties） directly, and the weakest ones were NJFUP-poly08 and NJFUP-poly11. Using the 92 clones (varieties), the calculation of different genotype frequencies of each primer amplified loci have been completed, and the amplified standard fingerprint of the high polymorphism of 10 microsatellite primers have been constructed, too. This study based on SSR molecular marker technology, plans to do research and make development of microsatellite variety identification technology, and form a set of real, simple, rapid, reliable molecular identification techniques about Populus deltoides Marsh clones (varieties). It will rovide key technical support for the healthy and sustainable development of poplar industry, as well as the theory basis for the further development and utilization of poplar resources in the future.

Key words: Populus deltoides Marsh；SSR molecular marker technology；genetic identification；DNA map

目 录

1 前言 1

1.1 综述 1

1.2标记技术的特点及应用 2

1.2.1几种分子标记技术的比较 2

1.2.2 SSR技术的特点及应用 3

1.3 研究工作的比较与总结 6

2材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 DNA的提取 8

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 9

2.2.3引物 9

2.2.4 SSR-PCR扩增反应 7

2.2.5 PCR产物的电泳检测 8

2.2.6 ABI3730毛细管电泳 8

2.2.7 数据分析方法 8

3 结果与分析 9

3.1 多态性位点的统计结果 9

3.2 基因型频率统计结果 10

3.3 美洲黑杨指纹图谱的分析 14

4 讨论 24

致谢 25

参考文献 26

1 前言

1.1 综述

美洲黑杨（Populus deltoides Marsh.）为杨柳科（Salicacae）杨属（Populus L.）黑杨（Aigeiros）树种。落叶乔木，树形高大，干形通直圆满，尖削度小，分枝粗度中等，叶片大，心形，叶色鲜绿，观赏价值较高；美洲黑杨木材材质洁白、柔软，易加工，可广泛用于包装用材、旋切用材和纤维用材，在解决胶合板材、纸浆材、薪碳材以及生态造林等方面均发挥着重要作用^[1]。此外，美洲黑杨还具有以下优点：①生长快，产量高；②抗病虫，耐旱、耐寒、耐热；③用途广泛，经济效益好；④对土壤肥力无破坏性等^[2]。 美洲黑杨在我国长期的栽培过程中，培育出了大量的无性系、品种，目前已广泛投入到了生产使用中。因此优良无性系的选用是速生、丰产的基础。生产上，为保持亲本的优良性状，多采用扦插育苗造林。因此，美洲黑杨产业发展中，建立准确可靠的无性系真实性鉴定技术，是一个急需解决的难题。

在杨树产业蓬勃发展过程中，造林种苗是否为真实的优良品种，是杨树林优质高产的基础。为确保杨树产业健康发展，急需建立一套真实、简便、快速、可靠的杨树品种遗传真实性鉴定技术，以满足对杨树种苗生产的检查和监督、对新品种的检测和认定，以及对育种工作者的知识产权进行保护的需要^[3]。

植物品种遗传真实性鉴定的关键是其所依赖的技术手段。以往植物品种鉴别所采用的方法主要是依据植物的形态特征，但植物品种间、无性系间在形态上的差异，往往并不十分显著^[4]。自上世纪八十年代以来，现代分子标记技术的应用，为植物新品种的鉴定提供了准确可靠的技术手段。分子标记是以DNA为基础的标记技术，是指能反映生物个体或种群间基因组差异的特征DNA片段，也称DNA指纹图谱^[5]。常见的分子标记有RFLP、ISSR、RAPD、AFLP、SSR等。其中，SSR即微卫星DNA，又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下^[6]。微卫星标记是目前不同标记类型中，用于植物品种遗传真实性鉴定的最高效的分子标记。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：①数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；②具有多等位基因的特性，提供的信息量高；③以孟德尔方式遗传，呈共显性；④每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物^[7]。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制等研究中。

1.2标记技术的特点及应用

1.2.1几种分子标记技术的比较

DNA分子标记技术能够在分子水平上直接反映物种的遗传多样性，在品种鉴定领域具有很大优势^[8]。但不同的分子标记有不同的优势，在品种鉴定方面也各有利弊，挑选适宜的标记方法成为了品种鉴别的关键。其中，随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、扩增酶切片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，ISSR）、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）等几种分子标记技术已被广泛应用于植物品种鉴定和亲缘关系分析的研究中^[9-11]。利用分子标记技术进行植物新品种检测，要求所选择的分子标记技术具有以下特点：多态性高、稳定性强、可靠性好、特异性高等。限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）标记技术是发展最早的分子标记技术，是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的^[12-13]。但这种方法所需DNA量较大，操作技术复杂，对操作人员和仪器设备均要求较高，因此其在指纹图谱构建中的应用受到了限制^[14]。随机扩增多态性DNA（RAPD）是建立在PCR(Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术^[15]。运用这种方法进行品种鉴别时，引物的DNA溶解温度较低，在实际操作中，扩增结果容易受到整体温度和DNA片段大小的影响^[16]。而且，该技术的稳定性和重复性均较差，实验结果的可靠性不高，因而也不适宜在品种鉴定中应用。扩增酶切片段长度多态性（AFLP）也是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。运用这种方法进行品种鉴定时，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性^[17]。该技术具有可靠性好，重复性强，多态性高等优点，但AFLP引物是根据通用接头序列设计的，没有物种特异性。这对DNA提取的质量要求很高，容易受到外源DNA的信号干扰。而植物材料或多或少都会有外源或内源微生物，提取某一品种没有任何外源污染的DNA在实际实验中很难做到。因此，运用这一技术进行品种鉴定容易产生争议。简单序列重复区间（ISSR）与RAPD和RFLP相比，揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美^[18]。其引物还可以在不同的物种间通用，应用于检测领域非常方便。但ISSR的稳定性差，重复性也不高，且PCR扩增反应易受许多因素的干扰。简单重复序列（SSR），也称微卫星DNA，也是以PCR扩增为基础的标记。相对于其他标记技术，SSR标记要简便、快速。同时SSR引物是由待检物种的基因组序列开发而来，具有极高的种属特异性，检测结果不易受到样品中存在的外源DNA的信号干扰。综合各方面因素，SSR是植物品种鉴别中高效且最为可靠的分子标记技术。

1.2.2 SSR技术的特点及应用

生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列（Tandem Repeats Sequence，TRS）和散布重复序列（Dispersed Repeats Sequence，DRS）^[19]。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首尾相连、成串排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成的（如rRNA和组蛋白基因）；另一类是由无功能的序列组成的。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。微卫星DNA（即SSR），其串联重复的核心序列为1～6bp，其中最常见是双核苷酸重复，即（CA)n和（TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同^[20]。

SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率^[21]。在真核生物中，存在许多2～5bp简单重复序列，其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。