摘 要

伸展蛋白家族是植物细胞壁中的主要蛋白成分，其表达量与细胞壁的伸展有明显关系。本实验挑选了该家族的两条mRNA序列（15W和22W），选取了6种不同种源地的美洲黑杨，截取其不同部位进行伸展蛋白的表达量检测实验。总RNA分别用TRIzol法和试剂盒法提取，结果表明试剂盒法的效果较好，TRIzol法提取的RNA降解较多。然后挑选其中一个样品的4个部位的mRNA，反转录成cDNA，根据以得知的杨树伸展蛋白基因序列，设计出引物，进行扩增，最后进行相对荧光定量PCR，测定伸展蛋白的表达量，以探究伸展蛋白在杨树不同部位的表达样式，以及不同cDNA的表达差异。通过扩增电泳图、扩增曲线和溶解曲线可以发现，茎尖部位的伸展蛋白表达量较高。

关键词 ： 杨树 伸展蛋白 RNA提取 RT-PCR 相对荧光定量PCR

Abstract

Extensin family is the major protein component of plant cell walls. And it's expression has significant relationship with the stretching of cell walls . This experiment picked out two mRNA sequences (15w and 22w) of the family , and selected six different varieties of populus deltoides. To intercept the different parts of then to do extend the expression of extensin detection. Total RNA was extracted from the TRIzol method and reagent kit . Found that the reagent kit method is better. The TRIzol method has more degradation of RNA. Then picked the mRNA of the 4 different parts of one sample to reverse transcription into cDNA. Designing primers and amplification according to the learned poplar expansin gene sequences. Finally, haveing the relative fluorescence quantitative PCR to determinate the amount protein expression of extension . To explore the extended expression of expansin in different parts of poplar style and the different cDNA expression .Through the pictures of the amplification and electrophoresis, the amplification curve and the solubility curve we can find that the stem-tip has higher expansin expression .

Keywords : poplar , extensin , RNA extraction , RT-PCR ,

relative fluorescence quantitative PCR

目 录

摘 要 I

Abstract II

前 言 1

1 文献综述 2

1.1 植物细胞伸展蛋白研究 2

1.1.1 植物细胞伸展蛋白研究进展 2

1.1.2 伸展蛋白的结构 3

1.1.2.1 一级结构 3

1.1.2.2 二级结构 3

1.1.3 伸展蛋白的功能 3

1.1.3.1 结构功能 4

1.1.3.2 伸展蛋白的表达量与细胞伸展的关系 4

1.1.3.3 防御和抗病抗逆功能 4

1.1.4 伸展蛋白的合成 5

1.2 杨树的特征及特性 5

1.2.1 杨树的形态特征 5

1.2.2 杨树的年生长节律 5

1.3 RNA提取 6

1.4 实时荧光定量PCR技术研究进展 6

1.4.1 相对定量PCR和绝对定量PCR 7

1.4.2 相对荧光定量PCR原理 7

1.4.2.1 荧光扩增曲 7

1.4.2.2 Ct 值 8

1.4.3 相对荧光定量PCR常用检测模式 8

1.4.3.1 TaqMan/TaqMan MGB 探针法 8

1.4.3.2 SYBR Green I 荧光染料法 8

1.4.4 荧光定量PCR技术的应用发展 9

2 实验目的 10

3 实验流程 11

4 实验结果与分析 12

4.1 引物设计 12

4.1.1 参考序列 12

4.1.2 引物设计要求及引物列表 14

4.2 样品采集 16

4.2.1 样品选择 16

4.2.2 样品处理 17

4.3 RNA提取 17

4.3.1 提取前准备 17

4.2.2 方法一——TRIzol法提取RNA 17

4.2.2.1 实验原理 17

4.2.2.2 提取过程 18

4.2.2.3 结果检测——琼脂糖凝胶电泳图 19

4.2.3 方法二——试剂盒提RNA 20

4.2.3.1 实验原理 20

4.2.3.2 提取过程 20

4.2.3.3 结果检测 21

4.2.4 RNA提取结果分析 24

4.3 反转录-聚合酶链式反应 25

4.3.1 实验原理 25

4.3.2 实验前准备 26

4.3.2.1 实验试剂 26

4.3.2.2 实验器材 26

4.3.3 实验过程 26

4.4 相对荧光定量PCR 27

4.4.1 引物扩增反应体系 27

4.4.1.1 引物扩增反应液配置 27

4.4.1.2 PCR程序设定 28

4.4.2 引物筛选 28

4.4.2.1 初步筛选 28

4.4.2.2 引物检测 29

4.4.2.3 最终确定的引物 30

4.4.3 相对荧光定量PCR 31

4.4.3.1 扩增曲线 31

4.4.3.2 溶解曲线 33

4.4.3.3 数据测定 34

4.4.4 结果分析 35

5 致谢 36

6 参考文献 37

前 言

伸展蛋白是植物细胞壁中的主要蛋白质成分, 是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白,它普遍存在于各种植物的细胞壁中。伸展蛋白与其它蛋白质相同，其生物合成也是从mRNA 的转录开始的，被转录的mRNA 在细胞质中再被翻译为富含脯氨酸的多肽。40多年来, 关于伸展蛋白结构的研究已经获得了突破性的进展, 对其功能的认识也比较深刻和全面。

目前在伸展蛋白的mRNA的全序列研究发现，杨树不同部位的组织中伸展蛋白的表达量有明显的差异。本实验拟通过对杨树嫩叶、叶柄、茎尖和根尖部位从提取RNA开始，到反转录成cDNA ，最后进行相对荧光定量PCR分析，来探究伸展蛋白在其不同部位中的表达样式。作为细胞壁形成必须蛋白，其表达量与细胞壁的伸展有明显的关系，可以增加细胞壁的机械强度。通过深入开展木本植物伸展蛋白研究，有望在提高木材的机械强度方面开拓一个新的领域。

目前通过对杨树cDNA文库的筛选，我们已经获得了14种杨树的伸展蛋白的mRNA序列。本研究拟选取其中的一条mRNA序列，设计引物，分别取材于处于春季的美洲黑杨的根、茎、叶片等部位进行相对荧光定量PCR分析，来探讨美洲黑杨的不同部位的相关蛋白的表达差异与功能的联系，以为后期的杨树品种鉴定奠定基础。