摘 要

：植物伸展蛋白家族是植物细胞壁的重要组成部分，富含羟脯氨酸，普遍存在于各种植物的细胞壁中，其生物合成与其他蛋白质相同，参与植物生长发育的各个方面。本实验针对该家族的两条mRNA序列(22W和15W)设计引物，选取处于旺盛生长期的4个种源地美洲黑杨的叶片部位进行荧光定量PCR试验，以探究不同种源地的蛋白表达差异，同时比较两种不同蛋白的表达式样，为后期杨树优良品种的选育提供理论依据。结果表明，22W号伸展蛋白在S3114号样品中表达较高，15W伸展蛋白在NT1号样品中表达较高。

关键词：伸展蛋白；提取总RNA；反转录；实时荧光定量PCR

Abtract:Extensin proteins are important compositions in plant cell wall, which are hydroxyproline-rich glycoprotein, common in all kinds of plant cell walls, and have the same synthetic biology with other proteins. And it takes part in all the kinds of plant’s growth and development. This experiment design the primer for the two mRNA sequence (22W and 15W) for this family, and select the leaf of Populus deltoides Marsh from 4 samples in their hearty stage to conduct a Fluorescence quantitative PCR experiment, in order to study the difference of the expression of the proteins from different populations, and compare the expression style of the two different kinds of proteins. All of the above can lay the foundation for the identification of breeding good varieties of poplar later. The results are that the extensin 22W express the most in sample S3114, and the extensin 15W express the most in Sample NT1.

Keywords：extensin；extraction total RNA；RT-PCR；real-time fluorescent quantitative PCR

目录

前言 1

1文献综述 2

1.1伸展蛋白的研究进展 2

1.2伸展蛋白的结构功能 2

1.2.1结构 2

1.2.2功能 3

1.3杨树特点 4

1.3.1发展杨树的意义 4

1.3.2杨树的形态特征 4

1.4杨树的种植资源 5

1.5实时荧光定量PCR技术 6

1.5.1原理 6

1.5.2优势 8

1.5.3应用 8

2实验目的 8

3.技术路线 8

4.试验方法 9

4.1引物设计 9

4.2样品采集与处理 12

4.3总RNA提取 12

4.3.1提取前准备： 12

4.3.2提取过程： 12

4.4反转录 18

4.4.1反应过程 18

4.5引物筛选 19

4.5.1反应过程 19

4.6实时荧光定量PCR 23

4.6.1操作方法 23

5.实验结论 29

6.致谢 30

参考文献 31

前言

伸展蛋白是植物细胞壁中的主要蛋白质成分，是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白^[1],它普遍存在于各种植物的细胞壁中,约植物初生壁干质量的1%~15%^[2]。伸展蛋白与其它蛋白质的生物合成相同，都是从mRNA 的转录开始的，被转录的mRNA 在细胞质中再被翻译为富含脯氨酸的多肽。50多年来, 对于伸展蛋白结构的研究取得了很多进展, 较为全面的认识了其功能。伸展蛋白的涉及植物生长发育的许多方面，包括花粉的识别与受精，细胞分裂与分化，生物与非生物胁迫反应，细胞伸长的停止，衰老与脱落等。伸展蛋白是细胞壁的必须蛋白，其表达量与细胞壁密切相关，可以增加细胞壁的机械强度。通过深入开展木本植物伸展蛋白研究，有望在提高木材的机械强度方面开拓一个新的领域。

目前在伸展蛋白的mRNA的全序列研究发现，某些mRNA可能在转录过程中有不同的剪接方式，该不同的剪接方式可能会导致其编码蛋白的不同功能。本实验拟通过杨树的不同品种来验证不同的剪接方式形成的mRNA的表达量，判断其功能的差异。

目前通过对杨树cDNA文库的筛选，我们已经获得了14种杨树的伸展蛋白的mRNA序列。本研究拟选取其中的一条mRNA序列，设计引物，分别取材于处于春季的美洲黑杨的根、茎、叶片等部位进行相对荧光定量PCR分析，来探讨美洲黑杨的不同品种的相关蛋白的表达差异与功能的联系，为以后对于杨树优良品种的选育提供依据。

1文献综述

1.1伸展蛋白的研究进展

伸展蛋白（extensin）又名伸展素，是植物初生细胞壁中含量丰富的一类结构蛋白，是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGP）^[1]，它普遍存在于各种植物的细胞壁中，双子叶植物细胞壁中含量约为干质量的1%~15%^[2]。1960年Lamport和Dougall确认细胞壁中存在蛋白质，之后对细胞壁研究日趋活跃，50多年来，有关伸展蛋白结构的研究取得了突破性的进展，对其功能的研究也取得了比较深刻和全面的认识。

通过研究拟南芥，烟草、番茄、甜菜等植物的伸展蛋白结构，发现它是多基因族而不是由单个基因所编码的。可见，不同植物中的伸展蛋白基因各不相同, 同一种植物中存在多种不同的伸展蛋白， 不同的伸展蛋白在初级结构上又相互不同。现在，虽然也有人认为伸展蛋白的多种 mRNA可能是由单个基因编码、经过不同拼接方式产生的， 但伸展蛋白多基因族的观点已基本上得到了承认。

目前已开展的伸展蛋白研究主要以草本植物为主，木本植物中的研究则相对较少，虽然草本植物的研究结果对木本植物提供了有益的借鉴，但木本植物细胞壁有其特殊构造，要了解伸展蛋白对木本植物细胞壁形成和其在细胞壁结构中的作用，还必须以木本植物为材料开展研究。木本植物的模式物种杨树的全基因组序列已经完成测序，为在木本植物中深入开展伸展蛋白研究提供了良好的基础。通过深入开展木本植物伸展蛋白研究，有望在提高木材的机械强度方面开拓一个新的领域。

1.2伸展蛋白的结构功能

1.2.1结构

伸展蛋白是一种糖蛋白，一般由l条多肽链组成，并富含羟脯氨酸残基，双子叶植物细胞壁中其含量约为干质量的l％一15％。伸展蛋白是在植物细胞壁中极为冗余的结构蛋白家族，在整个植物界从单细胞的团藻、低等的苔藓植物，到高等的裸子植物、被子植物中均有表达。伸展蛋白有2个主要特征，即翻译后脯氨酸残基的羟基化、羟脯氨酸及丝氨酸残基的糖基化，有些种类伸展蛋白还进行分子内和／或分子间的交联反应^[3]。

1.2.1.1伸展蛋白的一级结构

伸展蛋白富含羟脯氨酸，蛋白质核心氨基酸组成中羟脯氨酸的含量一般为总氨基酸摩尔数的30％~40％。非蛋白质部分糖基的组成主要是阿拉伯糖(Ara)和半乳糖（Gal），含量为糖蛋白的60％左右。含特征结构单位Ser-Hyp-X-Hyp-Hyp，其中X为非羟脯氨基酸多肽或单氨基酸，或缺失氨基酸。由于含有大量的赖氨酸，其等电点在10左右，故为碱性蛋白^[4]。

1.2.1.2伸展蛋白的二级结构

据圆二色性（CD）的研究表明，伸展蛋白的二级结构呈多聚脯氨酸Ⅱ型构象。Lamport用分子模型描述了这个构象：多聚脯氨酸Ⅱ型螺旋体是左手螺旋，每圈有三个氨基酸残基，螺距为0.94nm，β- 连接的四阿拉伯糖苷向里折叠，与螺旋体构成巢状；一个阿拉伯糖残基与多肽主链的羟基形成三个氢键，因而这种排列形成了一个有一定强度的稳定的棒状分子^[4]。

1.2.1.3 伸展蛋白的高级结构

伸展蛋白的高级结构重点在于伸展蛋白的交联。Stafstrom等在电镜下看到了多肽分子中的IDT 结，发现整个伸展蛋白都可形成IDT，但分子间的IDT 比分子内的IDT多得多，并证实结的分布与Tyr-Lys-Tyr的分布相关。分子内的IDT可增加分子的刚性，防止旋转，同时可调控分子间IDT的频度^[4]。

1.2.2功能

1.2.2.1表达的广泛性

伸展蛋白几乎涉及植物生长发育的各方面，包括花粉的识别与受精，细胞分裂与分化，细胞伸长的停止，衰老与脱落，生物与非生物胁迫反应等。伸展蛋白针对不同胁迫的生理反应，都与细胞壁结构功能相关^[2]。

1.2.2.2是细胞壁形成必须的结构蛋白

Lamport等认为，含羟脯氨酸的蛋白是活性的正在生长的细胞的细胞壁的必须成分^[2]。

1.2.2.3与细胞壁机械强度的关系

Lamport等指出伸展蛋白是一种典型的结构蛋白而不是酶蛋白，它在细胞壁中通过肽间交联形成一个独立的网状系统与纤维素网系互为补充，形成致密的经纬网结构，起到控制纤维素微纤丝滑动、增加细胞壁的强度和刚性、控制细胞壁伸展、调节植物形态建成的作用。此外，由于伸展蛋白结合到其它细胞壁多聚物上，赋予了细胞壁一定的韧性^[2]。

1.3杨树特点

1.3.1发展杨树的意义

杨树（Populus）是我国重要的造林树种。在速生丰产林建设中占有重要地位。杨树具有早期速生、无性繁殖容易、能够容易实现无性系育种等优点。杨树用途广泛，主要用于生态防护林（三北和农用防护林）和工业用材林（包括板材、木浆和包装材原材料）^[7]。

我国杨树人工林的数量占全国人工林总面积的19%，是世界有关国家种植杨树人工林总和的4倍，是种植杨树人工林的第一大国。

1.3.2杨树的形态特征

杨树是杨柳科杨属植物，该属的特点是，冬芽具数鳞片，芽有树脂，常有顶芽。叶有长柄，叶片阔。柔荑花序，下垂；花有杯状花盘；雄蕊4至多数；苞缘细裂。蒴果2—4裂，风媒花^[8]。

1.4杨树的种植资源

世界杨树分为5派，即黑杨派、青杨派、白杨派、胡杨派和大叶杨派，其中青杨派资源最多，黑杨派次之，胡杨派最少。

1. 黑杨派

本派天然品种不多，但经济价值和遗传价值极高，目前世界上人工栽培的杨属品种有90%以上都源于黑杨派。按照美国杨树专家Donald I.Dickmannn（1983）年的最新划分，黑杨派共有3个种^[7]，如下：