摘 要

镉是一种白色有光泽的金属，具有很强的毒性，生物积蓄性强。在人体中其半衰期可达到 6.2至 18 年。随着它被大量用于冶炼和开采及种种商业活动，镉污染的治理问题已经刻不容缓。常用的镉离子检测方法如原子吸收光谱法、高效液相色谱法、紫外分光光度法等，虽然都可以提供高灵敏度、优秀的选择性和准确的结果，但缺点是仪器昂贵、检测时间长并且样品预处理步骤复杂。

为了对重金属镉进行及时有效的监控，本课题以经修饰的镉离子特异性DNAzyme切割产生的小片段DNA为引物，通过向体系中引入的padlock为模板，进行酶连与滚环扩增反应。以滚环扩增产物中poly T为模板，通过氧化还原反应产生基于poly T 的荧光铜纳米颗粒，并通过其产生的荧光强度来检测样品中镉离子浓度。本研究建立的基于DNAzyme的Cd² 核酸生物传感器具有灵敏的高、易制备等特点，为环境中微量Cd² 的检测提供了一种新的方法。

关键词：DNAzyme；核酸生物传感器；镉离子；荧光

Study on DNAzyme-based Cd² nucleic acid biosensor

ABSTRACT

Cadmium is a white lustrous metal with strong toxicity and bioaccumulation. In humans, the half-life can reach 6.2 to 18 years. As it has been widely used in smelting, mining and various commercial activities, the treatment of cadmium pollution has become an urgent issue. At present, the commonly used methods of cadmium ion detection, such as atomic absorption spectrometry, high performance liquid chromatography, ultraviolet spectrophotometry, can provide high sensitivity, excellent selectivity and accurate results. But the common shortcomings are expensive instruments, long detection time and complex sample pretreatment steps.

Therefore, in order to monitor cadmium in time and effectively, we used small fragments of DNA produced by modified cadmium ion-specific DNA zyme as primers and padlock as template for enzymatic ligation and ring-rolling amplification. Poly T was used as template to produce fluorescent copper nanoparticles based on poly T by redox reaction. The concentration of cadmium ion in samples was measured by fluorescence intensity generated by poly T nanoparticles.

Key words：DNAzyme；Nucleic acid biosensor; Cadmium ion; Fluorescence

目 录

第一章 文献综述 - 1 -

1.1 重金属镉的概述 - 1 -

1.1.1 重金属镉的毒性危害 - 1 -

1.1.2 重金属镉的传统检测手段 - 2 -

1.1.2.1 原子吸收光谱法（AAS） - 2 -

1.1.2.2 高效液相色谱法（HPLC） - 2 -

1.1.2.3 紫外分光光度法 - 2 -

1.2 生物传感器检测法 - 2 -

1.2.1 脱氧核酶 - 2 -

1.3 滚轮扩增 - 3 -

1.4 荧光铜纳米颗粒 - 4 -

1.5 本论文的研究与意义 - 4 -

第二章 实验材料与方法 - 6 -

2.1 实验材料与试剂 - 6 -

2.2 实验方法 - 6 -

2.2.1 镉离子催化下DNAzyme对底物进行切割 - 6 -

2.2.2 底物切下部分3'端去磷酸化 - 7 -

2.2.3 滚轮扩增环形模板DNA的制备 - 7 -

2.2.4 滚轮扩增产物的形成 - 7 -

2.2.5 基于滚轮扩增产物的CuNPs形成与荧光检测 - 7 -

2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 - 7 -

2.2.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 - 8 -

第三章 结果分析与讨论 - 9 -

3.1 检测方法原理概述 - 9 -

3.2 利用dPAGE方法对DNAzyme切割可行性分析 - 10 -

3.3 DNA环化过程的优化 - 11 -

3.4 滚环扩增环节反应时间的优化 - 12 -

3.5 基于T30的荧光铜纳米颗粒的形成及Cu² 浓度优化 - 12 -

3.6 基于建立检测体系对Cd² 进行检测 - 13 -

结论 - 14 -

致 谢 - 16 -

参考文献 - 17 -

第一章 文献综述

重金属镉的概述

镉（cadmium, Cd）是一种稀有元素。金属镉呈银色，熔点 320.9℃，是从锌矿石或硫镉矿中提炼出来的副产品，大多用于电镀保护钢、铁、铜、黄铜等制品时让其免受腐蚀和锈损 ^[1]。重金属镉作为一种优良金属可以用来吸收中子，实验中常将镉棒用作控制棒以达到减缓核反应堆中的链裂变反应速率的目的。同时，镉的硫化物颜色鲜艳，是制成颜料的极佳工具，可用作高级油漆和绘画颜料^[2]。此外，镉也可以用来制造各种合金，例如镉（98.65%）镍（1.35%）合金则可用于航空发动机，而家用电器开关，汽车继电器则常用银氧化镉^{[3, 4]}。随着镉的开采量和工业的排放量逐年增加，镉污染也越来越严重。

^[1]1.1.1 重金属镉的毒性危害