马尾松与黄山松EST-SSR引物设计与PCR反应体系优化毕业论文

 2021-04-20 11:04

摘 要

马尾松与黄山松EST-SSR引物筛选需要多项技术支持。遗传标记在育种和种质资源相关研究工作中具有十分重要的地位。DNA分子标记是直接在DNA分子水平上检测生物间的差异,是生物在DNA水平上遗传变异的直接反映,是分类学、遗传学、育种学和物种起源与进化等研究的重要技术指标之一。EST-SSR标记不仅具有传统SSR标记共显性、重复性好、丰富的多态性等特点。本文根据公共数据库中四个松属树种EST序列的SSR基元类别、重复类别等结构特征进行了分析;采用编号pmhc-13引物,以浓度为60ng/μl的一个马尾松样品DNA为模板,通过正交试验设计,确定了其PCR反应体系为Mg2 1.5mM/L、引物0.2μM/L、dNTPs 0.6mM/L、Taq酶0.2U/μl,还确定了在此条件下,退火温度为59℃时可获得理想的扩增主条带。

关键词:马尾松;黄山松;SSR;PCR体系优化

EST-SSR primers design and PCR optimation of

Pinus massoniana . and Pinus hwangshanensis .

ABSTRACT

Primer screening of EST-SSR primers of Pinus massoniana and Pinus hwangshanensis required many technical support. Genetic markers played an important role in breeding and germplasm resources research. DNA molecular marker was directly used to detective the biological differences on the DNA molecular level, and was a direct reflection of biology at the DNA level of genetic variation. What is more, it was one of the important technical indexes of taxonomy, genetics, breeding and species origin and evolution. The EST-SSR tag not only had the traditional SSR marker, but also had good repeatability and characteristics of abundant polymorphism. According to the SSR element categories and public database of four pine species, the article analyzed the sequences of EST type structure by orthogonal experimental design, using the primer coded pmhc-13 and a DNA template from Pinus massoniana whose concentration was 60ng/ul, we find out that the PCR reaction system was Mg2 1.5mM/L, 0.2 μ M/L primer, dNTPs 0.6mM/L, Taq 0.2U/L. Meanwhile,whtn annealing temperature was 59 ℃, ideal main bands obtain can be amplified.

Key words:Pinus massonianaPinus hwanshanensis; SSR; PCR optimation

目录

1 前言 - 1 -

1.1 马尾松与黄山松简介 - 1 -

1.2 DNA分子标记研究进展 - 1 -

1.3 微卫星标记 - 3 -

1.3.1 基本原理与特点 - 3 -

1.3.2 SSR标记组成分析 - 3 -

1.3.3 遗传图谱构建方面研究 - 4 -

1.3.4 遗传多样性方面研究 - 5 -

1.4 研究的目的和意义 - 6 -

2 马尾松与黄山松EST-SSR引物开发 - 7 -

2.1 方法 - 7 -

2.1.1 一般引物设计原则 - 7 -

2.1.2 EST-SSR的开发 - 8 -

2.2 结果与分析 - 8 -

2.3 讨论 - 12 -

3 SSR反应扩增体系优化 - 14 -

3.1 材料与方法 - 14 -

3.1.1 材料 - 14 -

3.1.2 PCR扩增 - 15 -

3.1.3 PCR反应因素水平与正交表设计 - 15 -

3.1.4 退火温度梯度试验 - 15 -

3.2 结果与分析 - 16 -

3.2.1 马尾松与黄山松DNA提取 - 16 -

3.2.2 反应因素水平正交设计 - 16 -

3.2.3 退火温度选择 - 18 -

3.3 讨论 - 18 -

结 论 - 19 -

致 谢 - 20 -

参考文献 - 21 -

1 前言

1.1 马尾松与黄山松简介

马尾松(Pinus massoniana)是我国亚热带特有的重要用材树种之一,也是绿化荒山的主要先锋树种。主要分布于江苏(六合、仪征)、安徽(淮河流域、大别山以南)、河南西部峡口、陕西汉水流域以南、长江中下游各省区,南达福建、广东、台湾北部低山及西海岸,西至四川中部大相岭东坡,西南至贵州贵阳、毕节及云南富宁.遍及南方15省(区),跨经度约20°,含纬度12°,面积约200万平方千米。在长江中下游其垂直分布于海拔700m以下,长江中游海拔1100m-1200m以下,在西部分布于海拔1500m以下,是中国最重要的常见树种之一[1]

黄山松(Pinus hwanshanensis)为分布于我国东南沿海山区的一种重要树种,在我国亚热带东部河南、江西、浙江、安徽、湖南、福建、台湾各地均有分布。作为中山地带优良的风景林、水土保持林与水源涵养林,黄山松具有极大的经济价值、生态价值和社会价值。黄山松为喜光,耐干旱的树种,喜欢凉润、空中湿度较大的高山气候,在土层深厚、排水良好的酸性土壤和向阳山坡生长较好,其根系深广,在海拔高处菌根极发达聚集如束,扩大了根系的吸收面,增加吸收能力。强度和硬度较马尾松高,质量坚实,富含树脂,耐久用,可供建筑、器具、板材,木纤维工业原料使用,树干可获得树脂,为长江中下游地区海拔700m以上酸性土壤重要的绿化和造林树种[2]

1.2 DNA分子标记研究进展

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